華東師大翁傑敏組多篇論文聚焦巴豆醯化修飾丨BioArt特別推薦

BioArt按：發生於組蛋白賴氨酸上的翻譯後修飾如甲基化和乙醯化在轉錄調控、DNA損傷修復、DNA複製等生命過程中起著重要調控作用。近年來賴氨酸修飾研究的一大重要進展是發現賴氨酸不僅存在乙醯化修飾，還存在一系列脂醯化修飾如巴豆醯化、丙醯化、丁醯化、琥珀醯化、丙二醯化等，其中組蛋白巴豆醯化的修飾因其廣泛發生於組蛋白並與基因表達活化相關越來越受到研究者的重視。儘管目前已有一些相關研究報道組蛋白巴豆醯化能促進轉錄，但組蛋白巴豆醯化在細胞轉錄中的重要性及與乙醯化修飾的關係還有待闡明。5月12日，來自華東師範大學生命科學學院、上海市調控生物學重點實驗室翁傑敏課題組在Cell Research雜誌上在線發表了題為「Class I histone deacetylases are major histone decrotonylases: evidence for critical and broad function of histone crotonylation in tranion」的研究性論文，系統的證明了Ⅰ型組蛋白去乙醯化酶（HDAC）是細胞中關鍵的組蛋白去巴豆醯化酶。其次，他們首次獲得了喪失去乙醯化酶活性但保留了去巴豆醯化酶活性的HDAC1和HDAC3突變體。通過利用這類突變體他們發現在不影響組蛋白乙醯化修飾的條件下去除組蛋白巴豆醯化能廣泛抑制基因表達，首次表明巴豆醯化等非乙醯化修飾在轉錄調控中可能具有廣泛地與乙醯化不等同的重要作用。與此對應的，該實驗室的另一篇即將於本月底發表在Cell Discovery雜誌上的論文則系統的研究了已知的組蛋白乙醯化酶對組蛋白巴豆醯化修飾的調控，相關內容敬請關注。此外，今年2月份，來自華東師大生科院上海市調控生物學重點實驗室翁傑敏教授課題組與廖魯劍教授課題組合作在Journal of Proteome Research雜誌上在線發表了題為「Large-Scale Identification of Protein Crotonylation Reveals Its Role in Multiple Cellular Functions」的研究論文，首次通過蛋白組學的方法系統鑒定到了非組蛋白上1185個可以被巴豆醯化修飾的位點，並且詳細的分析了巴豆醯化修飾的序列特異性（motif），巴豆醯化修飾蛋白的亞細胞定位（富集於細胞核）以及這些被修飾的蛋白參與的生物學過程。

論文解讀：

發生於組蛋白賴氨酸上的翻譯後修飾如甲基化和乙醯化在轉錄調控、DNA損傷修復、DNA複製等生命過程中起著重要調控作用。近年來賴氨酸修飾研究的一大重要進展是發現賴氨酸不僅存在乙醯化修飾，還存在一系列脂醯化修飾如巴豆醯化、丙醯化、丁醯化、琥珀醯化、丙二醯化、戊二醯化、二羥基異丁醯化以及三羥基丁醯化等（見下圖），值得一提的是芝加哥大學趙英明教授課題組在這方面做了大量的原創性的重要工作（Sabari et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2011），其中組蛋白巴豆醯化的修飾因其廣泛發生於組蛋白並與基因表達活化相關越來越受到研究者的重視，圍繞識別巴豆醯化「閱讀器」的科學問題，清華大學李海濤教授課題組在這個領域也做出許多出色的工作（Li et al. Mol Cell 2016； Xiong et al. Nat Chem Biol 2016）。儘管目前已有一些相關研究報道組蛋白巴豆醯化能促進轉錄，但組蛋白巴豆醯化在細胞轉錄中的重要性及與乙醯化修飾的關係還有待闡明（Sabari et al. Mol Cell 2015）。

不同種類的醯化修飾。圖片引自：Sabari, B. R., Zhang, D., Allis, C. D., & Zhao, Y. (2016). Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nature Reviews Molecular Cell Biology.

組蛋白巴豆醯化（Histone crotonylation）修飾是由組蛋白巴豆醯基轉移酶（Histone crotonyltransferase， HCT）以巴豆醯輔酶A（Cr-coA）為底物將巴豆醯基轉移到賴氨酸殘基上產生的一種修飾。組蛋白巴豆醯化修飾是在2011年芝加哥大學趙英明教授課題組首次被鑒定出的一種新的翻譯後修飾（Tan M et al. Cell 2011），並且在精子發生過程中組蛋白上的巴豆醯化修飾丰度較高，可以作為一些轉錄活躍的性染色體相關基因的標誌。在體細胞中，組蛋白巴豆醯化修飾富集於轉錄起始位點上下游200-300 bp區域，且這種富集以轉錄起始位點為中心呈現對稱分布，表明組蛋白巴豆醯化修飾可以作為啟動子和活躍基因的精確起始部位的標誌。

基於組蛋白巴豆醯化修飾基團與組蛋白乙醯化修飾基團在結構上非常相似，並且關於這種新型組蛋白修飾的「writer」及「eraser」儘管有一些相關報道（Sabari et al. Mol Cell 2015；Bao X et al. eLife 2014），然而對於巴豆醯化在體內對轉錄調控缺少系統性的研究，因此，翁傑敏課題組對催化組蛋白巴豆醯化修飾及去組蛋白巴豆醯化修飾的酶進行了大規模的篩選，細胞內實驗結果表明，Class I HDACs（HDAC1，HDAC2，HDAC3以及HDAC8）可以去除組蛋白巴豆醯化修飾（見下圖）。

以上的結果表明組蛋白巴豆醯化修飾與組蛋白乙醯化修飾分享的同一套酶體系，並且實驗結果也表明在體外催化組蛋白巴豆醯化修飾可以促進轉錄，那麼在生理條件下組蛋白巴豆醯化修飾對轉錄的調控有多大的重要性？因此該課題組通過篩選大量的突變體，獲得了保留去組蛋白巴豆醯化的酶活但是喪失了去組蛋白乙醯化的酶活突變體（見下圖）。在有了上述僅可以去除組蛋白巴豆醯化修飾但是不能去除組蛋白乙醯化修飾的突變體後，為後續研究去組蛋白巴豆醯化修飾之後對轉錄的抑制調控提供了強有力的工具。

在該研究中，研究人員還通過在HeLa細胞中構建了HDAC1及HDAC1-VRPP的可誘導型穩系，通過RNA-seq分析表明去組蛋白巴豆醯化修飾之後可以明顯的抑制細胞的整體轉錄水平，也就表明組蛋白巴豆醯化修飾對轉錄的調控具有重要的作用（下圖）。

此外，為了進一步研究組蛋白巴豆醯化的生物學功能，研究人員在小鼠胚胎幹細胞中構建了可誘導的HDAC1及HDAC1-VRPP穩系。研究結果進一步表明組蛋白巴豆醯化修飾對胚胎幹細胞的自我更新具有重要的調控作用。

工作模型。

既然組蛋白上可以廣泛的發生巴豆醯化修飾，那麼非組蛋白（Non-histone proteins）上是否也可以廣泛的發生巴豆醯化修飾呢？因此，翁傑敏課題組與廖魯劍課題組在前期研究的基礎之上合作共同開展了這方面的研究，主要通過組學的方法分析了細胞內巴豆醯化修飾的蛋白譜及這些被修飾的蛋白參與的生物學過程。

首先，為了能鑒定到較多的巴豆醯化修飾的蛋白，該研究中使用了20mM的巴豆酸鈉處理HeLa細胞，細胞整體蛋白經胰酶消化成不同的肽段，再用泛巴豆醯化修飾抗體富集巴豆醯化修飾的肽段，利用LC-MS/MS分析首次鑒定到了453個蛋白上的1185個可以被巴豆醯化修飾的位點（見下圖）。此外，也對得到質譜結果詳細的分析了巴豆醯化修飾的序列特異性（motif），巴豆醯化修飾蛋白的亞細胞定位以及這些被修飾的蛋白參與的生物學過程。

為了對質譜結果的可靠性進行進一步驗證，研究人員隨機挑選了5個蛋白進行了生化檢測，並且選取了一些不能被修飾的蛋白作為陰性對照，結果表明了隨機選取的5個蛋白可以被巴豆醯化修飾但是選取的陰性對照蛋白即使在巴豆酸鈉處理的條件下都不能發生巴豆醯化修飾，這充分表明了該質譜結果的可靠性。此外，質譜得到的蛋白大多數為細胞核蛋白，這也與前期免疫染色的結果一致，巴豆醯化修飾的信號主要在細胞核富集，從而暗示了巴豆醯化修飾有著重要的生物學功能，並且為後續繼續研究巴豆醯化修飾提供的一定的基礎。

總的來講，上述工作圍繞巴豆醯化修飾做了大量系統性的研究，首次闡明了巴豆醯化等非乙醯化修飾在轉錄調控中可能具有廣泛地與乙醯化不等同的重要作用，此外，還通過蛋白組學鑒定到了大量可以發生巴豆醯化修飾的非組蛋白，這些工作為進一步研究巴豆醯化修飾在體內的生物學功能奠定了良好的基礎。

據悉，華東師範大學翁傑敏教授和上海交通大學附屬第六人民醫院、上海市奉賢區中心醫院俞建軍教授為Cell Research論文的共同通訊作者，魏偉、劉曉光、陳吉偉為本文共同第一作者，張會芳、高申楠、盧璐、王志強等同學參與了該項工作，中國農業大學陳忠周教授和華東師範大學石鐵流教授、李紀文副教授對該研究提供了重要支持與幫助。在Journal of Proteome Research雜誌上的論文中，華東師範大學生命科學學院廖魯劍教授和翁傑敏教授為共同通訊作者，魏偉為論文的第一作者，毛安琪和曾秋芳等同學參與了該項工作，此外，該工作還得到了唐彬、李紀文和杜憲興幾位老師的支持與幫助。

參與該課題的部分師生合影

參考文獻：

1、Sabari, B. R., Zhang, D., Allis, C. D., & Zhao, Y. (2016). Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nature Reviews Molecular Cell Biology.

2、Tan, M., Luo, H., Lee, S., Jin, F., Yang, J. S., Montellier, E., ... & Zhao, Y. (2011). Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell, 146(6), 1016-1028.

3、Li, Y., Sabari, B. R., Panchenko, T., Wen, H., Zhao, D., Guan, H., ... & Li, H.(2016). Molecular coupling of histone crotonylation and active tranion by AF9 YEATS domain. Molecular cell, 62(2), 181-193.

4、Xiong, X., Panchenko, T., Yang, S., Zhao, S., Yan, P., Zhang, W., ... & Li, H. (2016). Selective recognition of histone crotonylation by double PHD fingers of MOZ and DPF2. Nature Chemical Biology.

5、Sabari, B. R., Tang, Z., Huang, H., Yong-Gonzalez, V., Molina, H., Kong, H. E., ... & David, A. (2015). Intracellular crotonyl-CoA stimulates tranion through p300-catalyzed histone crotonylation. Molecular cell, 58(2), 203-215.

6、Bao X, Wang Y, Li X, et al. Identification of "erasers" for lysine crotonylated histone marks using a chemical proteomics approach. eLife2014; 3. doi: 10.7554

翁傑敏教授簡介

翁傑敏，博士，現任華東師範大學生命科學學院特聘教授、副院長、生命醫學研究所副所長。1984 年畢業於武漢大學生科院微生物學系獲理學學士學位， 1987 年畢業於中科院上海細胞所獲碩士學位， 1994 年畢業於美國 Vermont 大學微生物和分子遺傳學系獲博士學位， 1994-1997 在美國國立衛生研究院從事博士後研究。 1997 年至 2007 年間先後擔任美國貝勒醫學院分子和細胞生物學系助理教授、副教授。 2007 年起至今受聘於華東師範大學擔任生命醫學研究所副所長，並創建表觀遺傳學實驗室。翁傑敏教授在貝勒醫學院期間從事細胞核激素受體及轉錄共調節因子調控基因表達的分子機制研究，獲得許多突破性成果。回國後主要致力於組蛋白密碼識別蛋白的鑒定及功能研究、表觀遺傳調控因子在 DNA 甲基化的建立與維持、基因表達調控、腫瘤與疾病、胚胎幹細胞乾性維持與分化中的作用機制及功能研究，並取得重要研究成果，已在國際核心期刊發表論文 90多篇，其研究論文總被引達 7000 多次，曾連續三年入選愛思唯爾出版社評選的「中國高被引學者榜單」。近五年來以通訊作者身份在包括Mol Cell、Nature Communications（2篇）、Cell Research、Cell Reports、Stem Cells、JBC等雜誌上發表十多篇研究性論文。回國後最具代表性的工作是在國際上首次報道了UHRF1具有甲基化組蛋白H3K9的特異結合能力，並證明了UHRF1通過識別甲基化組蛋白和半甲基化DNA協同調控DNA維持性甲基化。翁傑敏教授2014 年還當選為「上海市優秀學術帶頭人」。

廖魯劍教授簡介

廖魯劍，博士， 現任華東師範大學生命科學學院及上海市調控生物學重點實驗室研究組長，教授、博士生導師。 2002 年獲得美國 Bowling Green 州立大學生物科學/神經生物學博士學位，先後在美國 Emory 大學及 Scripps 研究所從事博士後研究，後以 Staff Scientist 任職於 Scripps 研究所John Yates 實驗室。 2012 年 5 月回國任中科院上海生化與細胞生物所/國家蛋白質科學研究中心研究員，獲得中科院上海生科院特殊人才計劃支持。 2013 年 8 月任華東師範大學生命科學學院教授、博士生導師，建立功能蛋白質組學實驗室。主要致力於蛋白質組學的方法開發和神經退行性疾病的信號轉導通路研究。從博士後階段開始進入蛋白質譜領域，在定量蛋白質組學新方法探索和運用蛋白質組學方法研究神經退行性疾病做出了原創性的貢獻，成果分別發表在Nature Methods, PNAS, JBC 和 J Proteome Res 等期刊。目前以第一作者或通訊作者在上述期刊發表研究論文 10 余篇，在Neuron 上發表應邀綜述 1 篇。 利用定量質譜描繪的蛋白質差異表達譜和以高精度質譜發現的重要蛋白修飾譜為基礎，合作實驗室進一步研究的成果發表在Immunity, Cell, PNAS, Exp Neurol, Science等雜誌上。應邀為 PNAS, Anal Chem, J Proteome Res,Sci Signaling 等國際知名學術期刊審稿。

推薦閱讀：