喬傑：生殖遺傳醫學的進展和單細胞PGD/PDS

隨著環境污染及生育年齡的推遲，不孕不育率越來越高，WHO已將不孕不育症、癌症、心腦血管疾病列為當今影響人類健康的三大疾病。據統計，我國平均每8對育齡夫婦中就有1對不能正常受孕。試管嬰兒技術可有效解決不孕不育難題，自1978年世界上首例試管嬰兒在英國誕生以來，全世界試管嬰兒數已超過六百萬，胚胎植入前診斷/篩查（PGD/PGS）技術可以有效的提高試管嬰兒的成功率。

2015年4月25日，在中國遺傳學會遺傳諮詢分會—復旦大學第一期遺傳諮詢師培訓班上，北京大學第三醫院院長、婦產科主任、生殖醫學中心主任喬傑做了《生殖遺傳醫學的進展和單細胞PGD/PDS》報告，重點講述了PGD/PGS的定義、臨床應用，以及最新應用於生殖醫學領域的MALBAC技術，並對其未來發展做了預測。

胚胎植入前遺傳學診斷/篩查（PGD/PGS）的定義

PGD/PGS是胚胎植入前遺傳學診斷/篩查（Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening），是指在人工輔助生殖過程中，對胚胎進行種植前活檢和遺傳學分析，以選擇無遺傳學疾病的胚胎植入子宮，從而獲得正常胎兒的診斷/篩查方法。

這兩種技術均建立在試管嬰兒基礎之上，都可以直接篩除有問題的、不健康的胚胎，挑選正常的胚胎植入子宮，可有效避免遺傳病患兒的出生，阻斷致病基因的縱向傳遞，從而獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，避免因引產給孕母帶來的身心創傷。

生殖遺傳學診斷/篩查使用的技術

過去20年間，胚胎植入前遺傳檢測主要通過卵裂球活檢結合聚合酶反應(PCR)或熒光原位雜交(FISH),對胚胎的單基因遺傳異常以及有限的染色體異常進行檢測。近年來胚胎植入前遺傳檢測技術提高，出現一些新興的遺傳檢測方法,例如微陣列-比較基因組雜交(Array-CGH)以及單核苷酸多態性微陣列(SNP-array)技術，它們使得同時檢測23條染色體成為可能,並能以更高的精度檢測小片段染色體的拷貝數變化、以及結構改變等。這使得胚胎植入前遺傳檢測的應用價值不僅在於可排除遺傳異常胚胎,更可用於提高大齡生育、反覆流產等不孕不育人群的受孕率。

PCR技術1985年首次應用於遺傳病基因診斷，目前已有近百種遺傳病可用PCR 技術進行診斷和產前診斷。由於PCR技術可將微量的DNA擴增數百萬倍，因此它適應適用於各種來源的DNA標本，包括羊水穿刺、絨毛採樣、臍血胎兒血液採集、胎兒活檢、母外周血分離胎兒細胞、宮頸刷取細胞及著床前取細胞等。PCR技術在PGD中也面臨著一些問題：

熒光原位雜交技術（fluoresence in situ hybirdization,F I S H）是一種將分子生物學(探針)與細胞遺傳學(染色體)結合，檢測染色體異常的新技術。與傳統的細胞遺傳學方法相比，其優勢在於:(1)無需細胞培養，間期細胞即可用於雜交分析。(2)檢測時只需計數間期細胞核上不同的雜交點，比傳統的核型分析操作簡單。(3)與核型條帶分析方法相比,運用特定探針檢測更敏感,更具特異性，特別是對染色體微小片段異常的檢測，更有針對性。FISH也可檢測和定性標記染色體，因此非常適用於臨床染色體異常疾病的產前診斷。然而，FISH技術一次只能檢測一個或幾個候選位點，且需要細胞遺傳學家對每一例標本進行評判，這一過程平均要花費5－7個小時甚至更多的時間：

比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）技術是在FISH技術的基礎上發展起來的一種新的分子細胞遺傳學技術。該技術不需細胞培養，一次雜交實驗即可在整條染色體或染色體區帶水平對不同基因組間DNA序列拷貝數的差異進行檢測並定位，其在生殖遺傳學方面的臨床應用及面臨問題如下：

SNP-array技術，即單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism array)技術，它能夠檢測出大量的細微DNA改變和與染色體拷貝數(非整倍體)或染色體結構重排有關的異常改變。SNP分析能夠對所有的23對染色體都進行分析，不過其也有臨床應用局限：

單細胞測序為PGD/PGS提供了有力的工具

單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術，其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整基因組後進行高通量測序。2011年，《自然方法》雜誌( Nature Methods )將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一，2013年，《科學》雜誌（Science）將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。單細胞測序技術出現以後，就被迅速應用到生殖醫學領域，為人們研究人類胚胎髮育、獲知全部基因組信息提供了有力的工具。

謝曉亮教授是我國單細胞測序領域的領軍人物，他帶領研究組創建了一種新的人單細胞全基因組測序技術——多重退火成環循環擴增技術（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC），這是迄今為止在單細胞測序及相關領域最先進的技術。MALBAC利用特殊的引物，使得擴增子結尾互補成環，防止了DNA的指數性擴增，解決了擴增偏倚，同時保持了90%以上的基因組擴增覆蓋度，使得檢測單細胞中較小的DNA序列變異變得更容易，解析度提高，可以檢測單基因突變，以及同時檢測多個基因。

MALBAC技術發明之後，已陸續用於對人類單個細胞、單個精子細胞、單個卵母細胞等測序，並在實際臨床應用中取得了良好的效果：

案例1：

案例2：

預測：下一個PGD新技術的出現可能來自表觀遺傳學

最後，喬傑教授對PGD的發展進行了預測，她表示，與單細胞發展歷程相似，表觀遺傳學正成為主流。

表觀遺傳是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化，並最終導致了表型的變化。表觀遺傳的現象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation）、基因組印記（genomic impriting）、母體效應（maternal effects）、基因沉默（gene silencing）、核仁顯性、休眠轉座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。

孕婦血漿中胎兒表觀遺傳學標誌物可作為一個定性標誌物用於檢查實驗結果是否存在假陰性的指標,也可作為一個定量標誌,用於篩查妊娠相關性疾病。目前已有較多胎兒表觀遺傳學標誌被發現,部分已用於臨床相關疾病的篩查。通過診斷表觀遺傳學的改變，可以獲知胎兒的健康狀況。表觀遺傳學就好似一面鏡子，對疾病有直觀地反映，因此研究表觀遺傳學的改變就成了一項重要的課題。

2012年，英國劍橋大學報道了生殖細胞重新DNA甲基化的機制，同年，美國報道了哺乳動物早期胚胎基因組規模的、鹼基解析度的DNA甲基化時間軸。

2013年，Science雜誌報道了美國以人和小鼠大腦皮層頂葉為研究對象，發現了整個哺乳動物腦發育過程中整個表觀遺傳學重構情況，解析度達到單個鹼基。喬傑研究組與北大湯富酬教授等4個團隊共同研究了人腦全基因組hmC和mC圖譜，提示hmC在調節剪切及基因表達中的新作用。

2014年，喬傑課題組在Nature雜誌發表了人類早期胚胎的DNA甲基化圖譜，在同一期還有另兩篇研究人類早期胚胎表觀遺傳學的文章。到現在為止，診斷表觀遺傳學的方法和技術在不斷地推陳出新，這些都打破了傳統模式上產前診斷的限制，進一步開拓了從母體血漿中胎兒DNA上疾病診斷的醫學區域，使得無創診斷開始以一種全新的面貌出現在人們眼前，因此，喬傑教授預測，下一個PGD新技術的出現可能來自表觀遺傳學。