一篇Science告訴你單細胞測序的文章思路！

上周我們介紹了單細胞測序在發表高分文章中的應用情況：用這個技術發表的文章中，每4篇中就有1篇10分+，還不趕快了解一下！，在這篇文章中我們為大家介紹了一篇近40分的Nat Rev Immunol綜述說的單細胞測序的三個應用場景：

（1）分別研究病理和生理狀況中不同的細胞亞群

（2）揭示某類細胞中的細胞亞群

（3）研究某類細胞（分化中的）的命運決定點

另外，在去年7月份怪阿姨還寫過一篇文章：單細胞測序知多少？，今天我們就以具體的例子來看看這個技術在我們具體開展研究時候的應用。

這篇文章是今年4月20號發表在Scicence雜誌上的文章：

我們知道Science雜誌的主圖比較少（文章正文是5頁），這篇文章只有四個：

但是做的工作和研究內容都是非常多的，這一點可以從49頁的補充材料裡面看出來：

好了，下面我們說文章正題。

研究疾病：H3K27M gliomas，也就是組蛋白H3第27位賴氨酸（K）突變為甲硫氨酸（M）的膠質瘤。

主要研究方法：單細胞測序。具體的策略是這樣的，作者取了6位H3K27M膠質瘤患者的新鮮活檢組織，製備懸浮單細胞，然後用流式分選（FACS），然後進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。這裡大家注意單細胞測序前期細胞分選方法是流式分選。

結果：

1.H3K27突變型膠質瘤樣本單細胞檢測和結果整體展示

6個樣本共測定了2458個細胞，所以文章的第一個圖Fig1A展示的是這些細胞的基因在不同病人中的表達情況，而根據Marker基因的表達情況研究團隊排除了兩類非惡性細胞（nonmalignant）亞群（A圖中的NM和B圖中的Immune cell與Oligodendrocyte），接下來進一步從拷貝數變異和基因突變角度對「惡性細胞」基因水平的變異進行檢測分析（WGS/WES），就是圖中C和D展示的內容：

這一部分的結論是整體鑒定了6個患者單細胞層面RNA水平的表達變化及其在各患者中的表達譜和DNA水平變異情況，並進一步排除了非惡性的細胞亞群。

2. OPC惡性細胞亞群的確定和關鍵基因功能驗證

接下來，對第一步中的2259個「惡性細胞」的表達模式和特性進行分析，共找到了4個模塊亞群（program）：（1）細胞周期；（2）星形細胞分化（AC-like）；（3）少突細胞分化（OC-like）和少突膠質前體樣細胞（OPC-like）（下圖A）。然後，對模塊進行打分分析後發現細胞增殖這樣的「惡性特徵」主要在OPC這個佔比最高的細胞亞群，而OPC這個亞群具有幹細胞的特性：既能自我更新，又可以分化為AC或者OC（下圖B）；下一步通過RNA原位雜交分別對AC、OC和周期的Marker進行檢測（下圖C）：

在這一部分除了把OPC這個幹細胞特性的惡性細胞亞群確定了下來，還找到了位置這個亞群特性的關鍵分子PDGFRA和BIM1（命運決定點），並通過CRISPR/Cas9基因敲除手段進行了細胞增殖表型的功能驗證：

3. H3K27突變型膠質瘤與IDH基因突變型膠質瘤細胞構成和進化

由於H3K27突變型膠質瘤與IDH基因突變型膠質瘤在細胞組成上的相似性（均由AC、OC和幹細胞特性細胞亞群組成），研究團隊選取了IDH基因突變型膠質瘤作為對照，從細胞結構組成上，兩者的AC樣細胞組成比例類似，而OC和幹細胞特性亞群比例相差較大（下圖A-F），實際上在幹細胞特性亞群分類上，H3K27突變型膠質瘤主要是OPC亞群，而IDH基因突變型膠質瘤主要是NPC亞群（neural precursor cell）（下圖G），而在細胞周期相關基因的表達上，H3K27比IDH比重更高（下圖H），這些與其更高的侵犯性相對應：

接下來是從基因變異、染色體單倍型的層面來揭示腫瘤的異質性和進化的過程，我們就不展開說了，可參見上圖中的I-M圖，特別是L圖中的進化樹。

4.H3K27突變型膠質瘤在不同模型中的差異評價

在這一部分，研究團隊選取的不同的疾病模型，包括了病人的組織樣本、PDX模型、神經球（GS）和分化的膠質瘤細胞（DGC），並通過單細胞測序的方法來看這些不同的模式在模擬最初始的病人組織樣本時的特性，結果發現PDX是模擬程度最高的，而其它的模型只能部分模擬原始腫瘤的特性。

最後他們繪製了正常發育和H3K27突變型膠質瘤進化過程中的示意圖：

大家可以看到這張圖裡面體現的信息包括了正常與H3K27突變型這一亞型膠質瘤進展過程中的細胞分化過程，也體現了具體的命運決定點（基因）的信息。

好了，文章的介紹就到這裡了，最後我們說明一些想法：

單細胞測序技術的優勢我們已經在用這個技術發表的文章中，每4篇中就有1篇10分+，還不趕快了解一下！裡面做過介紹了，我們知道技術的進步會推動各個領域觀念的個性，反過來很多好的idea如果沒有技術的支持是沒法實現的；再退一步說，很多時候大家不能畢業的原因不是沒有idea，而是WB沒做好，所以這個問題需要辯證的看。再者說，這篇文章裡面用到的細胞分選技術是流式（FACS），而非微流控晶元；從文章來看，除了這個技術外文章的思路和分析也是我們需要學習的，這個算是研究門檻或者風險提示吧。上次我們發了單細胞測序的介紹後，很多同學留言說價格太高，做不起，我個人是完全理解的，也相信單細胞測序的價格肯定會大幅度下降，就像電腦的技術革新一樣，可能10年後單細胞測序會成為像PCR一樣的常規技術，可問題是，當單細胞測序成為我們能承擔的常規技術後，肯定又會有新的技術是我們承擔不起的，高精尖的技術和高分文章註定只能少數人有機會。