DPD酶與氟尿嘧啶類藥物不良反應及療效相關性

1．簡介

氟尿嘧啶類藥物在抗腫瘤治療中應用廣泛，包括5-Fu（5-氟尿嘧啶）及其衍生物。這類藥物在多種惡性腫瘤中得到廣泛應用。臨床實踐中我們經常發現，儘管不同患者接受相同劑量強度5-Fu類藥物的治療，卻表現出來不同程度的不良反應和療效。體內80%的5-Fu由DPD 酶代謝^[1], 如果DPD酶缺陷則會導致5-Fu代謝物在體內的毒性蓄積。近年來，氟尿嘧啶類製劑的種類越來越多，例如替加氟，卡培他濱，S-1（替吉奧）等等。S-1由替加氟（FT）、吉美嘧啶（CDHP）、奧替拉西鉀（Oxo）三種藥物構成。CDHP能夠抑制在DPD酶作用下從FT釋放出來的5-Fu的分解代謝，有助於長時間血中和腫瘤組織中5-Fu有效濃度。故如果患者存在DPD酶缺陷，使用S-1則會出現嚴重併發症的。多項研究顯示DPD酶的在決定氟尿嘧啶藥物的毒性及有效性方面起很重要的作用，DPD酶活性的個體差異是決定不良反應和治療療效差異的最重要因素之一。以往對於DPD酶的研究往往停留在酶學水平，但是隨著測序技術的發展，對其研究也上升至基因組學水平。本文將對DPD 酶的功能、分布及檢測方法，及其基因與氟尿嘧啶類藥物的相關性進行闡釋。

2．DPD酶的結構、功能

DPD酶在人體大部分組織中廣泛分布，在肝臟中活性最高^[2]。另外，在腫瘤組織中也存在DPD酶。DPD酶在外周血單核細胞（PBMCs）中呈正態分布,與肝臟中的活性正相關^[3]。DPYD基因編碼DPD酶，定位於人類染色體1p22，包括23個基因（共950kb）。DPD酶是由兩個相同亞單位構成的同型二聚體蛋白。每個亞單位由1 025個氨基酸組成^[4,5]。酶動力學研究表明DPD酶通過非經典的「乒乓」機制(ping- pong mechanism)發揮作用^[6]。DPD酶蛋白結構的解析為闡述DPD基因突變引起的氨基酸序列改變對活性的影響提供了理論基礎。

3．DPD酶缺陷的臨床表現

DPD酶缺陷表現為腫瘤患者接受氟尿嘧啶類藥物治療後出現嚴重甚至是致命性的毒性反應。1985年，Tuchman等報道了第一例乳腺癌患者接受常規5-Fu化療後出現嚴重腹瀉、骨髓抑制、神經毒性、意識混亂,發現血液及尿液中的嘧啶濃度異常升高，首次提出是因DPD酶缺陷導致5-Fu代謝障礙^[7]。接下來後續更多的研究報道了5-Fu治療後因DPD酶缺陷或不足而出現嚴重毒性。這些不良反應主要表現為胃腸道反應（黏膜炎）及骨髓抑制。

4. DPD酶缺陷的人群分布特徵

因為5-Fu藥物的廣泛應用，DPD酶缺陷或不足相關的5-Fu治療後嚴重毒性日趨受到臨床重視。納入1200例患者的meta分析提示大於30%的患者在接受5-Fu化療後出現藥物相關的毒性^[8]。DPD酶的人種差異被廣泛報道^[9]。既往的酶學研究顯示，高加索人種中DPD酶活性部分缺乏出現概率大約是3-5%,完全缺乏的概率為0.1%^[10]。亞州人群中DPD酶部分缺陷的比例佔0-0.7%^[10-11]。非裔美國人中這一比例為8％^[12]。

5.DPD酶分析的方法學

目前DPD酶活性的判定主要有3類研究方法，具體：評估DPD 酶活性；DPYD基因改變；及編碼DPD酶的mRNA改變。每種方法均有其利弊。

5.1 DPD酶活性測定

雖然大部分DPD酶存在肝臟中，但是其他組織中的 DPD酶也在氟尿嘧啶的代謝中起重要作用。肝臟中DPD酶的活性和PBMCs中的具有相關性^[3]。因為雜合性的病理性突變部分所致的DPD缺陷患者PBMCs中的平均DPD酶活性大約是正常人群中的48% ^[13]。可用放射活性物質標記的 5-Fu 或者胸腺嘧啶去孵育分離的淋巴細胞，然後通過高壓液相色譜法檢測降解產物來檢測DPD酶的活性^[14-16]。但PBMCs中的DPD酶活性是否可直接反應人體中5-Fu的清除率是仍存在一定爭議。加上這種分析方式需要大量的試驗室工作和不菲的價格，故在臨床很少採用該技術。

2004年，Mattison等^[17]報道了另一個非侵入性的檢測方法。在口服2-¹³C-尿嘧啶後，由於DPD酶參與降解2-¹³C-尿嘧啶，故產生代謝產物¹³CO2。通過IR光譜儀方法檢測呼出氣體中¹³CO2濃度前後的變化可以分析DPD酶活性。研究者認為¹³CO2濃度的降低與部分或者完全的DPD酶缺陷相關。但是2-¹³C-尿嘧啶及IR 光譜儀設備並不是很好獲取，故限制了這一方法的臨床推廣。

此外，由於直接對DPD酶檢測方法都未在臨床廣泛應用，因此目前對DPD酶活性閾值也未達成共識。究竟DPD酶值低於多少被認為是DPD酶活性缺乏或不足呢?哪些病人需要謹慎給予低劑量5-Fu或採用其他藥物替代治療呢? 早前的研究根據群體DPD酶活性分布，將95％參考值下限作為DPD酶活性缺乏的臨界值。後來有研究者提提出，將DPD酶正常活性均值的70％作為DPD酶活性缺乏的臨界值，並發現39％－61％的出現嚴重毒性反應的患者DPD酶活性低於此臨界值^[18]。但是均沒有達到統一。

5. 2 DPD基因的多態性與酶活性的關係

DPD酶由DPYD基因編碼，核苷酸的變異可能導致DPD酶的結構及活性的變化。相比於酶活性的檢測，DPD的基因檢測時間短，實驗操作性強。故DPYD基因多態性與DPD酶活性的研究也越來越受到臨床醫生的關注。已有超過100個突變位點被報道及研究^[19]。較明確與DPD酶缺陷相關的突變有以下3個單核苷酸多態性 （single-nucleotidepolymorphisms，SNPs）：DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290),c.2846A>T(D949V,rs67376798)和DPYD*13(c.1679T>G,I560S, rs55886062)^[20]。

目前發現最為常見的導致5-Fu嚴重毒性的基因突變位點為DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290)，即14內含子5』剪切位點處鹼基GT突變為AT，可導致DPD酶失活^[21,22]。DPYD*2A(IVS14+1G>A,c.1905+1G>A,rs3918290)與另外2個SNPs相比更為常見，這個位點突變在非洲裔美國人及高加索人種中的頻率分別是0.1％及1.0%^[19,23-25]。體外實驗顯示若發生純合突變，則會導致DPD酶活性的完全失活^[26]。而且，多項臨床試驗也證明DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290)攜帶者更易發生3度以上的氟尿嘧啶類藥物相關不良反應。2015年發表在臨床腫瘤學雜誌（Journal of Clinical Oncology ，JCO）上的一項前瞻性研究，檢測了2,038 位接受氟尿嘧啶類為基礎方案化療患者的DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290), 22 (1.1%)例為雜合突變，並進行減量治療。突變攜帶者的中位劑量強度是 48%( 範圍：17%-91%)。與歷史對照，3級毒性反應的發生率從73%降至28%；藥物導致的死亡率從10% 降至0%^[27]。

c.2846A>T(D949V,rs67376798)是在2000年被首先報道的，其變異導致 DPD酶結構的變化，進而干擾輔因子結合或者電子傳送。在非裔美國人及高加索人種中的突變頻率分別為0.1 到1.1%^{[19,23-24,28]}。體外試驗證明 c.2846A>T(D949V,rs67376798)純合突變酶活性降為59%^[26]。雖然相關研究沒有DPYD*2A多，但仍然有多項臨床研究及meta分析顯示 c.2846A>T(D949V,rs67376798) 與氟尿嘧啶類藥物相關毒性有關，並且需要進行藥物減量。Rosmarin等^[29]人的研究發現c.2846A>T(D949V,rs67376798)與卡培他濱3級以上相關毒性的比值比是9.35 (p = 0.0043)。

DPYD*13(c.1679T>G ,I560S, rs55886062)在高加索人種中的突變頻率只有0.07 到0.1%^[23,24]，與前2位點相比，發生頻率最低，而且只在酶活性下降的人群中出現，酶活性正常的人群未發現過^[30]。體外試驗證明DPYD*13(c.1679T>G ,I560S, rs55886062)純合突變酶活性下降75%，幾乎導致了酶活性的完全失活^[26]。DPYD*13(c.1679T>G ,I560S,rs55886062)突變的患者在多個臨床試驗中顯示出現過嚴重的藥物不良反應。

以上3個位點是目前確認的與氟尿嘧啶類藥物毒副反應相關的突變位點。c.496A > G,

的突變頻率比DPYD*2A，c.2846A>T，DPYD*13都要高，但是與氟尿嘧啶毒性的相關性沒有得到證實。一項納入64例接受奧沙利鉑＋氟尿嘧啶＋伊立替康3種藥物治療的腸癌患者的研究發現，19%的患者有c.496A> G突變，且與3-4級的毒性相關（OR＝4.93,95% CI 1.29,18.87; P = 0.021）。^[31]

上文提過，DPD酶活性可能是由於DPYD基因人種差異導致，所以SNP在亞洲人群的情況是怎樣呢？稍感意外的是，日本及韓國的3項研究均沒有檢測到DPYD＊2A(IVS14+1G>A,c.1905+1G>A,rs3918290)位點的突變^[32-34]。來自中國的研究統計了DPYD 基因SNPs在122例中國漢族人群中的突變情況，也沒有檢測到DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290)的突變^[35]。意味著該位點可能在亞洲人中與DPD酶活性關係較小。相反的，2015年在亞洲進行的一項納入764例患者的meta分析顯示DPYD＊5在中國,韓國, 泰國人群中的突變頻率能達到 >20%，85T>C（DPYD*9A）在日本人和韓國人中的突變頻率分別為3.7%及2.5%，中國人高達7.04%，納入的研究都報道了5-FU為基礎的嚴重化療毒性（≥2級或者3/4級）可能與這些常見的多態性位點相關，化療毒性主要集中在胃炎、骨髓抑制、腹瀉，也有心律失常的報道^[36]。

鑒於DPYD基因突變與毒性的關係，美國CPIC（TheClinical Pharmacogenetics Implementation Consortium）推薦在DPYD*2A(IVS14+1G>A,c.1905+1G>A,rs3918290), DPYD*13(c.1679T>G ,I560S, rs55886062)和c.2846A>T(D949V,rs67376798)雜合突變的患者中起始氟尿嘧啶類藥物的治療時需減量至少50％,然後根據毒性反應及葯動學調整劑量。若是純合突變，則選擇別的藥物治療^[37]。有意思的是，近期荷蘭科學家甚至建立了一套評分系統，根據PCR 方法檢測出DPYD*2A(IVS14+1G>A, c.1905+1G>A,rs3918290), c.2846A>T(D949V,rs67376798),DPYD*13(c.1679T>G ,I560S, rs55886062)或者 c.1236G>A/HapB3的突變狀態，每種突變賦予不同的比重，根據總值來判斷是否需要減量及具體減量多少^[38]。

5.3 DPYD基因研究困境及展望

除了以上3個位點，還有許多其他位點突變尚需進一步研究。最近，科學家發現有DPD酶活性下降的非洲裔美國人26%中存在rs115232898位點的突變，導致酶活性下降了46%^[39]。2015年柳葉刀雜誌發表了一項meta分析，列入了8項臨床研究中的7365位患者，發現c.1236G>A/HapB3與氟尿嘧啶藥物相關毒性顯著相關 (矯正RR:1·59,95% CI 1·29–1·97, p<0·0001)。並且細化到毒性反應的類型上，發現c.1236G>A/HapB3與胃腸道毒性及血液學毒性相關, 但是與手足反應無關^[40]。

但是存在這些突變並不意味著一定會出現酶活性的下降及治療毒性。Morel 等^[41]進行了一項列入487患者的研究，均接受了基於5-Fu的治療，並檢測了22個DYPD基因的SNPs，包括IVS14 + 1G>A, 2846A>T, 1679T>G等。發現DPYD*2A 及 c.2846A>T 突變與治療毒性相關。300例患者並沒有單核苷酸多態性，其中20例患者出現嚴重毒性反應。187例存在SNP的患者中，僅24例出現嚴重毒性反應。這意味著除了DPYD基因以外，還有些其他因素與 5-Fu藥物毒性相關。這包括5-Fu代謝參與的其他多種酶，例如胸苷酸合成酶（thymidinephosphorylase, TS）、乳清酸磷酸核糖轉移酶（orotatephosphoribosyltransferase , OPRT）等。這些酶若異常表達也可能會影響5-Fu的不良反應和療效^[42]。此外DYPD的SNPs超過100個，臨床上是否應該擴大SNPs的檢測來提高敏感性和特異性也尚無定論。但是，目前隨著二代測序等技術的發展，短時間內可同時檢測多個位點，能幫助我們高效、迅速地獲取突變結果，這一技術已經在DPYD基因檢測中得以應用^[19]。發表在2014年GUT雜誌上的一項研究表明，在968例英國腸癌患者中進行二代測序，發現2個常見的多態性位點與卡培他濱的毒性有關，分別是rs12132152 及 rs12022243。特別是 rs12132152與手足綜合征的發生密切相關。在1個患者中發現了少見的p.Ala551Thr突變，通過功能預測，證實其與卡培他濱的毒性有關^[43]。

因為DNA突變會導致mRNA水平或者pre-RNA 的異常剪切，故有人猜想DPD酶活性還可能與DYPD mRNA表達相關。可通過實時定量反轉錄PCR方法檢測血液中的DPYD mRNA。一項納入157例患者的研究顯示DPD酶活性與血液中的DPYD mRNA相關^[44]。除了mRNA水平的改變，還有研究認為DPD酶的活性在表觀遺傳學上受到調節，即DYPD啟動子的甲基化以及miRNAs對甲基化過程的調節，在這部分上還有爭議，需要進一步探索^[45-46]。

6. DPD酶與氟尿嘧啶類藥物療效關係

1999年，Ishikawa和Kirihara等報道，體內腫瘤細胞DPYD基因表達及活性與5-Fu抗腫瘤敏感性有關。高表達的DPYD mRNA和活性水平可能會導致5-Fu藥物耐葯^[47-48]。對於大於60種人類腫瘤的細胞系研究顯示DPYDmRNA 表達、DPD活性與5-Fu 治療反應率呈負相關^[49-50]。另外,DPYD mRNA 表達低、DPD酶活性低移植瘤模型也呈現對5-Fu治療相對敏感^[51]。這都證明細胞內DPD酶的水平是5-Fu治療的重要預測因子。故一項前瞻性的臨床研究發現，在結直腸術後接受5-Fu輔助治療的68位患者中，腫瘤組織中DPD酶活性高與較差DFS及OS相關^[52]。

另外，有研究認為5-Fu類藥物的毒性越高，療效越佳。一項奧地利的研究顯示227例接受卡培他濱＋貝伐珠單抗治療的乳腺癌患者，出現手足綜合症（Hand Foot Syndromes,HFS）後進展或者死亡風險可降低 44%；死亡風險能降低56%。HFS 越重，對OS的影響越大^[53]。這是否與DPD酶活性相關值得進一步探索。

7. 結論

DPD酶在5-Fu藥物治療中起了重要的作用，檢測及評估DPD酶的活性是開始氟尿嘧啶類藥物治療前重要的步驟，能提高有效性和避免嚴重不良反應。DPD酶在腫瘤組織的表達情況與療效關係對於指導臨床用藥具有一定價值。在蛋白或者基因水平前瞻性地檢測DPD酶活性或者 DPYD基因型是個體化腫瘤治療時代的重要方向。

原文發表在2016年6月《癌症進展》

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