12天，看一部耐葯菌的演化史

大約兩分鐘前，我空降在了一片未被開發過的區域。這片區域看起來有著相當豐富的營養，儘管有阻力，但我還可以向周圍運動。這看上去是個繁殖的好地方。我是一個大腸桿菌（Escherichia coli），大概20分鐘後，我將會有第一代後代，而它還會進一步產生更多的「我」——有的時候，我們長得不完全一樣，但畢竟也是我的子孫嘛。相信很快我們就能佔領這片區域。

44個小時過去，這片地方已經全是我和我的後代們的了。那些去得比較遠的先行者告訴我，遠方還有未經開發的區域，但是那片區域似乎被什麼東西污染了，它們感到很難受。可如果只在這裡呆下去，營養也會被用完的。我的後代們必須做出覺悟。

現在，距離剛來的時候已經88個小時，那個有毒的區域還是被新的後代適應了！它們跟老家的先輩們比起來更不一樣了。後來的一部分小傢伙看上去具有更高的耐性，但早被勇敢的先行者們堵在了後面，這個問題看上去很難解決。先要加把勁佔領這裡再說吧。

第132小時，上一片區域也被佔滿了。我們不得不來到新的地方——地方很大，但也更加危險。不過我們已經有了應對的經驗，就這麼繁殖下去，反正總會有個別新傢伙有辦法適應。這不，我們來了。

第176小時，我們似乎陷入了絕境。許多先行者死在了更遠的區域，為什麼會這樣？那片區域的污染太嚴重了，可腳下這個區域的營養已將耗盡了！它無法再容納我的後代了！該怎麼辦？

沒想到終於還是到達了這個被重度污染的區域！第220個小時，天知道我對自己的身體做了什麼。我感覺到自己顯然沒有之前那麼健康了。我的同行者更少了，身邊大部分同類都死於這些該死的污染。但我還活著，相信它們也會想到辦法跨過這道坎。我們還能製造更多的後代。

哈哈，早已大不相同的我和我的後代們終究還是在這片地方興盛了起來。現在是第264個小時，這裡的毒素對我們來講已經不再是任何問題。少部分先行者已經到達了更遠、含有更高濃度毒素的區域，依然有許多同類在死去。可那又怎麼樣？等著吧，我們一定能征服那片區域的。

培養板上的演化之路

上面這個大腸桿菌的故事，發生在哈佛醫學院羅伊·契肖尼（Roy Kishony）「平板演化」實驗上。在不足兩周的時間中，它演化出了耐受高濃度抗生素的能力。在受到耐葯菌威脅的今天，科學家正在兩個方面進行努力——一部分科學家在嘗試研發更多的抗菌藥物；而另一部分科學家，包括契肖尼，則在試圖搞清楚這些生物的能力究竟是怎麼來的。根據契肖尼和同事在《科學》上發表的文章，大腸桿菌從普通病原到抗藥性極強的細菌的轉變，只需要12天的時間。

大腸桿菌所處那片廣袤而受到不同程度污染的「土地」，是契肖尼和他的小組為了模擬微生物適應演化，設計的一個「軟平板」。他們把這個裝置稱為「微生物演化與成長板」（microbial evolution and growth arena，MEGA）。這塊體積達到了120x60厘米的巨型培養板由兩層瓊脂培養基構成。位於下層的培養基固體，成分不會自動擴散，因此研究人員可以按照自己的需求設置不同的抗生素濃度形成梯度。而位於上層的軟瓊脂培養基使得細菌不會像在正常的固體培養基上被「固定」成一個一個菌落，它們能夠沿著這塊板進行遊動，擴散到它們能夠生存的區域。契肖尼在整塊下層瓊脂平板上注入了黑色的墨水。大腸桿菌在形成菌落時會蓋住下方墨水的顏色，這樣，研究人員就能夠直觀地看到它們最終能走到哪裡。

契肖尼的MEGA板。圖中這一塊是用於觀察甲氧苄啶（TMP）適應進化的MEGA板，在MEGA板兩側添加的大腸桿菌將擴散到MEGA板中央含有高濃度TMP的區域。圖片來源：參考文獻[1]

契肖尼準備了兩套這樣的「競技場」。除了兩段的接種區，「競技場」的其他區域分別含有不同濃度的甲氧苄啶（Trimethoprim，TMP）和環丙沙星（Ciprofloxacin，CPR）兩種常見的抗生素。在TMP板中，它們的最小濃度單位為3個最小抑菌濃度（MIC）——1個MIC的量，就能夠抑制大腸桿菌的生長。而當大腸桿菌們成功適應了3MIC的梯度後，它們還將面臨30/300/3000倍MIC的「高山」。而在CPR板中，這個數字有所減小，但如果要使子孫覆蓋整個「競技場」，大腸桿菌也最終需要征服高達2000MIC的濃度才行。

而結果你已經知道了：那些大腸桿菌不但適應了對它們來說極為致命的抗生素濃度，而且速度是驚人的——12天和15天，這是它們分別攻克TMP和CPR板最高抗生素濃度區所花的時間。

大腸桿菌（白）在TMP板上12天的培養過程。圖片來源：參考文獻[1]

而這實在是太快了。

超級抗性是怎樣煉成的

為了弄清楚大腸桿菌快速演化的背後發生了什麼，契肖尼在含有TMP的MEGA板上隨機挑選出位於不同梯度的菌落進行基因組測序，來搞清楚這些適應性背後的機制。按照測序的結果，研究人員將「變異菌群」分為兩組：含有超過60個基因突變的高突變組，以及基因突變不超過12個的低突變組。

在MEGA板上採集的樣本會用於基因組測序。圖片來源：參考文獻[1]

在所有高突變組中，一個被稱為dnaQ的基因都出現了變異。這一基因負責編碼DNA聚合酶III，在DNA複製的校對中扮演著關鍵角色。dnaQ的失活意味著細菌的DNA的複製會變得錯誤百出。在沒有抗生素壓力的「和平年代」，這樣的不穩定會為菌落的持續生長增添額外的負擔。但此時此刻，更多的錯誤將意味著更多的可能性——包含那些能夠適應抗生素的可能。這部分可能帶給整個大腸桿菌群落更大的生存幾率。然而，這樣的大腸桿菌抵達最高抗生素濃度區域的時間與低突變組的菌大致相同，這讓研究者將分析的焦點放在了低突變組。

在低突變組中，一個名為folA的基因被反覆突變掉。folA是二氫葉酸還原酶的編碼基因，也是抗生素TMP作用的直接位點。這一基因的失活，可能將使得TMP無處著力。除了folA之外，一些與TMP抗性並無首要關聯的基因也發生了突變。這其中包括與大腸桿菌應激反應相關的mar和sox，以及許多與TMP抗性相關的轉錄和翻譯元件。

儘管這樣的突變能賦予大腸桿菌更強的抗藥性，但大部分時候，這都會以犧牲自己的生長速率為代價。在適應的初期，它們的生長速率會明顯放緩。可即使這樣一個短暫的「剎車」，也會對大腸桿菌造成巨大的影響。不過，在適應了篩選的環境後，細菌們又會找到辦法回復之前的生長速度。MEGA板上空間有限，對於單個大腸桿菌菌落來說，複製一旦放緩，競爭者就會「超車」跑到它的前面。契肖尼發現，在抗生素梯度「邊界」處的大腸桿菌，往往並非那些最能耐受抗生素的菌群。那些能夠耐受最高濃度抗生素的菌群，往往會由於空間不足被硬「擠」在低濃度抗生素區——把這類「懷才不遇」的菌群移到抗生素濃度梯度的邊界上，它們能夠擴散更遠的距離。

值得注意的是，儘管大腸桿菌在所展現的適應能力令人咋舌，但契肖尼和同事的其他實驗，那些「一步登天」——能夠直接從0跳到在最高濃度抗生素壓力下存活的細菌並不存在，適宜的「中間濃度」也許是發生適應性進化的必要條件。

不同濃度設置下的TMP抗藥性實驗。t為培養時間。圖片來源：參考文獻[1]

MEGA板的存在使得人們得以在空間和時間兩個維度來直觀地觀察細菌抗藥性的演化史，這也促使人們進行思考未來如何更加有效地與之對抗。對抗生素和耐葯菌之間關係的研究有很多，但人們很少意識到的是，在一個真實的環境中，演化程度並非決定種群密度的唯一優勢。一些時常被人忽視的因素，比如複製速度和菌群密度，都可能成為耐葯菌傳播擴散的桎梏。藉助更多這樣的信息，科學家們也許能夠發現更為恰當的對策應對耐葯菌的威脅。

（編輯：Calo）

1. Baym, Michael, et al. "Spatiotemporal microbial evolution on antibiotic landscapes." Science 353.6304 (2016): 1147-1151.

文章題圖：參考文獻[1]

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