致癌恐慌籠罩「基因魔剪」，CRISPR成功編輯的幹細胞或是定時炸彈

來自專欄 DeepTech深科技

編者按：6月11日，Nature子刊 Nature Medicine上同期發表了兩篇關於抑癌蛋白p53對CRISPR在人多能幹細胞中進行基因編輯的影響：CRISPR基因編輯造成的DNA雙鏈斷裂會激活p53，引起人多能幹細胞的凋亡。而最後被「篩選」存活的細胞，很有可能存在p53功能缺陷——多種惡性腫瘤的特徵。這種細胞在移植入體內後很可能具有極高的致癌風險，雖然尚無直接實驗證實其致癌性。

這兩篇文章為CRISPR的安全性再次敲響警鐘。這提醒我們，在應用於人體之前，CRISPR還有一段路要走。未來使用其他種類的Cas9蛋白，或是選擇性暫時抑制p53活性有可能會解決這個現在棘手的問題。

CRISPR 技術曾一度被認為前景無量，也因為其高精確度和快速的特點被無數人看好，希望它可以為基因治療帶來新曙光。然而，隨著各種試驗的開展，越來越多的科學家開始質疑這項技術的副作用。

繼去年5 月底 Nature 子刊 Nature Methods 發表的一篇文章表明「基因編輯技術有可能會在引起基因組內數百種尚不確定的基因突變」後（於今年 4 月 27 日撤稿），6 月 11 號，發表在 Nature Medicine 兩篇文獻接連報道 CRISPR-Cas9 成功編輯的人多能幹細胞可能存在致癌風險。CRISPR-Cas9 的致癌性仍未得到直接驗證，但是，此次研究引發科學家關於該技術仍需優化的討論。

與此前 Nature Methods 那篇基於小鼠數據的實驗結果不同，這兩篇均是來自於人多能幹細胞的實驗結果，這無疑給開發 CRISPR 基因編輯療法的企業當頭一棒。受此影響，CRISPR Therapeutics 股價在 6 月11 日暴跌，至今日仍未見明顯迴轉。

圖 | CRISPR Therapeutics 股價走勢（圖源：Google Finance）

根據論文，瑞典卡羅林斯卡研究所（Karolinska Institutet）和諾華（Novartis）的研究人員科學家們發現，使用 CRISPR-Cas9 成功編輯的多能幹細胞很可能有 p53 缺陷，這將增加腫瘤風險。按照他們的說法，「這些基因編輯細胞就彷彿是定時炸彈一樣」。

在這次的挑戰之前，CRISPR 技術曾逃過兩次大劫——一是該技術曾被控告脫靶率出奇高，但此控告在 2017 年 4 月被撤回，二是人體對 Cas9 的免疫應答存在問題，最終卻被敷衍為「可解決的」。不過，對於 6月11日發表的實驗結果，我們目前還無法做更多確認。

CRISPR Therapeutics 公司的 CEO Sam Kulkarni 表示，這些結果「看起來是有道理的（plausible）」。儘管這些研究主要集中於用正常基因取代致病基因的應用，而非 DNA 序列剪切，他還說：「這是我們該重視的地方，尤其是現在 CRISPR 療法被應用于越來越多的疾病中。我們要確保這些編輯過的細胞不會在返輸回體內後成為癌細胞。」另一位該領域的領軍科學家（其與某基因編輯公司有密切關係，因此不便透露姓名），認為這兩項研究「十分震撼人心」，並且對曾經疏忽了這一方面的 CRISPR 療法表示了擔憂。

圖 | CRISPR 基因編輯的幾種方式（圖源：CRISPR Therapeutics）

另一方面，馬薩諸塞大學醫學院（University of Massachusetts Medical School）的 Erik Sontheimer 說，其實來自諾華的那篇文章初稿自去年暑期就已經發布了預印本，但是當時 CRISPR 界的專家們並沒有「驚慌失措」。他本人的研究方向是探究 CRISPR 技術的新型酶和脫靶效應。他還提到：「這是一件值得注意的事，但我覺得這並不意味著 CRISPR 技術無法應用到疾病治療中。」

卡羅林斯卡研究組和諾華研究組分別在人類視網膜細胞和多能幹細胞中對 CRISPR 進行了試驗。兩種細胞中的實驗結果是類似的，這引起了研究人員的重視。典型的 CRISPR-Cas9 的工作原理涉及剪切雙螺旋 DNA 鏈的兩條鏈，這導致細胞內「急救基因」 p53 的活化：修復 DNA 斷裂或者導致細胞「自殺」。然而，不論是哪種途徑，p53 活化的結果將使 CRISPR 技術無法發揮作用，因為剪切後的 DNA 鏈不是被重新連接起來就是細胞死亡。諾華研究組還證明 p53 基因的活化使得 CRISPR 在多能幹細胞中的效率降低了十七分之一。這大概就解釋了為何 CRISPR 技術效率極低，即使是在病毒載體的幫助下，也只有極少數細胞的基因組被成功編輯。

圖 | 腫瘤抑制蛋白 p53（圖源：Wikipedia）

「我們發現 CRISPR-Cas9 剪切基因組時會活化 p53，」卡羅林斯卡研究組的第一作者 Emma Haapaniemi 如是說，「這使得基因編輯變得更加困難。」

換一個角度思考，細胞能被 CRISPR 技術成功編輯，是因為 p53 功能的失常導致細胞失去修復 DNA 的能力和失去程序性死亡的能力。但問題是 p53 功能失常也意味著癌症的發生，並且這不是一個偶然的現象：幾乎一半的卵巢癌患者，43% 的結直腸癌患者，38% 的肺癌患者，將近 1/3 的胰腺癌、胃癌和肝癌患者，以及 1/4 的乳腺癌患者都具有 p53 突變。

諾華研究組最初的研究目的是探究如何增加 CRISPR 編輯多能幹細胞的效率，因為多能幹細胞具有分化成為所有種類細胞的潛能，這樣就可以利用基因編輯來治療各種各樣的疾病。該公司在馬薩諸塞州劍橋市的研究所的神經科學家 Ajamete Kaykas，成功將 CRISPR 技術編輯人多能幹細胞 DNA 的效率提到 80%。然而，不幸的是，大部分細胞最終都沒能存活。存活下來的細胞很有可能存在 p53 功能失常，從而引發腫瘤風險。這一結論在文中的 p53 缺陷實驗中獲得證實。

圖 | p53 缺陷的人多能幹細胞大多能「熬過」 CRISPR 基因編輯，而普通的大部分都凋亡了（圖源：Nature Medicine）

因此，諾華組總結道：「確保 p53 在基因編輯前後都有功能這一點非常重要。」卡羅林斯卡研究組也認為在使用 CRISPR-Cas9 技術發展基因編輯療法的時候需要審查 p53 和其他相關基因仍具有正常功能。

但是，有關 p53 的這個發現並不意味著 CRISPR 就「玩完了」。第一，卡羅林斯卡研究所的生化學家 Bernhard Schmierer 認為，「這兩篇文章呈現的只是初始數據，這個發現在臨床實驗使用的細胞中是否屬實還未清楚。」第二，p53 這個問題可能會因為使用其他的 DNA 剪切酶（而非 Cas9）而減輕，此外，其他途徑的基因剪輯也可能並不涉及到 p53 活化。

CRISPR 編輯基因的途徑有兩種。第一種叫做非同源性末端接合 (NHEJ)，或者損傷性修復，即剪切下一大段致病基因，以非同源的鹼基補上。這是 CRISPR 治療鐮刀形紅細胞病採用的方法。第二種叫做同源性重組修復（HDR），也叫糾正性基因修復，即剪切下致病基因後以同源的正常鹼基補上。目前，有幾所大學的實驗室正在致力於利用 HDR 來治療一些疾病，如杜興氏肌肉營養不良症。

圖 | 非同源性末端接合與同源性重組修復（圖源：Emendobio）

Haapaniemi 說在他們組研究的正常、成熟細胞中，損傷性修復「在 p53 被活化的情況下也會發生。」這對於 CRISPR Therapeutics 鐮刀形紅細胞病等使用 NHEJ 途徑的項目來說是莫大的好消息。但是，美國食品藥品監督管理局（FDA）還是在 5 月份暫停了 CRISPR Therapeutics 鐮刀形紅細胞病的人體研究。不過，p53 這個發現也應該不會影響 Intellia Therapeutics 和 Regeneron 對澱粉樣變的研究。

根據相關科學家，賓夕法尼亞大學有關 CRISPR 技術編輯 T 細胞來對抗腫瘤的一項臨床試驗，也不存在 p53 功能異常這個問題。其他沒有將 DNA 雙鏈打斷的 CRISPR 基因編輯照理也不應該存在這個問題，如 Beam Therapeutics 的技術——由哈佛大學劉如謙所設計，用正確的鹼基替換突變的鹼基。

不過，p53 問題確實會影響一些企業開發的治療方法，即那些使用了 HDR 方法的，包括對肝糖儲積症、囊狀纖維化和嚴重複合型免疫缺陷這些疾病開發的產品。

此外，在幹細胞中使用 CRISPR 技術也成為一個棘手的問題。諾華研究組表明 p53 失常似乎在 NHEJ 和 HDR 中都是必需條件。這表明在成功編輯了的幹細胞內有失能的 p53，而這會導致癌症的發生。

看到這兒，也許你會有疑問，為何以前沒有報道過 CRISPR 成功編輯的細胞會致癌？為何在小鼠身上的試驗沒有出現致癌的結果？

卡羅林斯卡研究組的 Haapaniemi 解釋說，這是因為這種效應出現在大型試驗中，比如他們組和諾華組，而在小型研究中很容易被忽視，因為人們只關注在一種細胞上編輯一種基因。當問及其他科學家時，她說：「似乎其他研究組目前還沒有發現 p53 在基因編輯中扮演的角色。」

來自加州大學伯克利分校的 Jacob Corn 說儘管他們實驗室在幾次實驗中注意到過 p53 突變的跡象，但當他們努力追蹤這些血液幹細胞在編輯後的生長效應時卻一無所獲。不過他也表明他並沒有理由去懷疑諾華組在多能幹細胞中的發現。

至於為何從未有人報道過 CRISPR 基因編輯會導致小鼠致癌，Haapaniemi 說：「這個問題問的好，」其中一個原因可能是，「實驗小鼠一般犧牲較早」，腫瘤還來不及發生。

不過，Jacob Corn 說他和其他研究者「已經在探索是否會導致腫瘤，但是目前沒有人發現相關的證據。」但是不管怎樣，他仍然覺得這兩篇文章「相當重要，因為這提醒了每一個人，基因編輯並不是一種奇蹟。」

總體而言，隨著越來越多研究表明 CRISPR 技術存在弊端，要將這項技術安全而高效地用於臨床治療還有很多路要走。