非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識

非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識

作者：《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制訂專家組

來源：中華醫學雜誌2015年12月8日第95卷第46期

近年來，表皮生長因子受體一酪氨酸激酶抑製劑( epidermal growth factor receptor-tyrosine kinaseinhibitors，EGFR-TKIs)等靶向藥物已經成為晚期非小細胞肺癌( NSCLC)重要的治療方式之一。在EGFR基因突變的晚期NSCLC患者，系列國際國內多中心臨床研究已證實EGFR靶向治療能顯著降低疾病進展或死亡風險、改善患者生活質量。而在EGFR基因未發生突變的肺癌患者中，臨床研究證據提示不宜使用靶向藥物。這些臨床研究和系統分析均指出EGFR基因突變檢測是晚期肺癌患者使用EGFR-TKIs治療的先決條件。

鑒於多種原因，臨床實踐中EGFR基因突變的肺癌組織受檢率並不高，導致基於驅動基因變異靶點的個體化治療策略難以實施。多項回顧性和前瞻性研究表明，當腫瘤組織難以獲取時，血液循環遊離或腫瘤DNA(cf/ctDNA)檢測是突變分析合適的替代選擇。

中國國家食品藥品監督管理總局(CFDA)在2015年2月已批准吉非替尼說明書更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應進行EGFR基因突變檢測基礎上，如果腫瘤標本不可評估，則可使用從血液（血漿）標本中獲得的ctDNA進行評估。

目前我國尚無規範化的血液EGFR基因突變基因檢測的標準或指南。因此，為了規範中國肺癌患者血液EGFR基因突變的檢測，特組織全國肺癌和病理學領域的知名專家共同制定本專家共識。

一、肺癌的流行病學

世界衛生組織下屬的國際癌症研究機構(IARC)於2013年12月12日公布了2012年全球癌症流行病學最新數據(GLOBOCAN 2012)：肺癌是世界範圍內發病率（新發肺癌患者182萬，占所有新發腫瘤病例的13%）和死亡率（死亡肺癌患者160萬，占所有死亡腫瘤病例的19.4%）最高的惡性腫瘤。在中國，肺癌的發病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤的首位。2012年中國新發肺癌患者約65.3萬，死亡患者約59.7萬。根據肺癌生物學特徵，NSCLC約佔所有肺癌的80% - 85%，肺腺癌的發病率已超過肺鱗癌。

EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域的激活對癌細胞增殖、生長的相關信號傳遞具有重要意義。EGFR基因兩種最主要的突變為19外顯子缺失（約佔45%）和21外顯子L858R突變（約佔40%），二者均可導致酪氨酸激酶結構域活化，且均為EGFR-TKIs的敏感性突變。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變陽性率在高加索人群約為10%，在亞裔人群和我國均為50%左右。 在過去十多年間，EGFR-TKIs已逐漸成為EGFR基因突變的晚期NSCLC患者的一線標準治療。具有里程碑意義的隨機、對照、大樣本Ⅲ期IPASS臨床試驗首次顯示吉非替尼一線治療EGFR基因突變晚期NSCLC患者的無進展生存時間、腫瘤緩解率和生活質量均優於標準化療，並且具有良好的安全性。隨後，基於EGFR基因突變陽性患者進行的前瞻性Ⅲ期臨床試驗( NEJ002、WJOG3405、OPTIMAL、EURTAC及LUX-Lung3 /LUX-Lung6)，通過與標準化療比較，充分驗證了EGFR基因突變是一線EGFR-TKIs治療的重要靶點和關鍵性預測標誌物。另一方面，CTONG0806等臨床研究和Meta分析顯示，在EGFR基因未發生突變的肺癌患者，因不能降低疾病進展或死亡風險，不宜使用EGFR靶向治療。因此，以組織和細胞學標本進行EGFR基因突變檢測用於指導NSCLC患者EGFR-TKIs治療已在全球形成共識，成為標準的臨床實踐。

美國國立綜合癌症網路(NCCN)指南建議：腺癌、大細胞癌及組織學類型無法確定等NSCLC應進行EGFR基因突變檢測；非吸煙、小活檢標本或混合型組織學類型的鱗癌患者也可考慮進行EGFR基因突變檢測；可採用多種方法進行檢測。

歐洲臨床腫瘤協會(ESMO)指南建議：晚期非鱗癌的NSCLC患者應進行EGFR突變檢測；除了從不吸煙或者很少吸煙（每年<15包）的鱗癌患者外，已確診鱗癌患者不推薦進行EGFR基因突變檢測。

美國臨床腫瘤學會(ASCO)於2014年簽署了一項美國病理學家聯合學會(CAP)／國際肺癌研究協會(IASLC)／分子病理學協會(AMP)關於肺癌患者選擇治療靶點分子檢測的臨床實踐指南，該指南明確指出：所有肺腺癌或者混合腺癌成分的肺癌患者，不考慮性別、種族和吸煙情況的特徵，均應進行EGFR檢測。

我國NSCLC患者EGFR基因突變檢測專家共識指出：所有NSCLC患者，不限組織學類型，只要條件許可，均應嘗試進行基於腫瘤組織的EGFR基因突變檢測。

來自腫瘤部位的手術組織、活檢組織以及細胞學標本，新鮮或甲醛固定石蠟包埋等處理的組織或細胞學標本，均可用於EGFR基因突變檢測。臨床取材方法主要包括纖維支氣管鏡下活檢、經皮肺穿刺活檢、胸水、手術、胸腔鏡、淋巴結穿刺活檢、支氣管內超聲引導細針穿刺活檢( EBUS FNA)等。

2015年歐洲肺癌大會(ELCC)上公布了一項全球10個國家562位腫瘤專家參與的關於晚期NSCLC患者EGFR基因突變檢測和治療策略選擇的調查研究結果：19%的晚期NSCLC患者未進行EGFR基因突變檢測，即使進行檢測，仍有26%的歐洲患者在結果出來前就開始接受治療。未進行檢測最常見的主要原因是病理組織學類型的限制（如鱗癌）；其次是缺乏足夠的腫瘤組織。檢測周期過長亦是未行EGFR基因突變的另一原因。在部分檢測中心，檢測周期甚至可達數周。此外，部分患者腫瘤內EGFR基因突變的異質性使基於基因檢測的靶向治療決策變得更加困難。

我國的EGFR基因檢測在肺癌患者中的受檢率相對偏低，張力等報道2012年我國肺癌EGFR基因突變受檢率為20% - 30%，明顯低於發達國家或地區的水平。如何在我國提高EGFR等基因變異受檢率是提升我國肺癌精準診治的關鍵因素之一。我國的肺癌EGFR基因突變受檢率低也是與臨床組織獲取受限、經濟原因、醫師與患者的精準診治意識、藥物昂貴及獲得不易等多因素相關。

針對臨床實踐中腫瘤組織檢測的種種局限，探尋作為其補充或替代的其他生物標本進行EGFR基因突變檢測具有重要臨床意義，有助於提高臨床患者的總體EGFR基因受檢率。

五、EGFR基因突變的血液檢測

研究顯示，大部分（並非全部）晚期NSCLC患者的血液中存在循環遊離DNA(cfDNA，cell freeDNA)。cfDNA主要來源於凋亡或壞死的細胞，包括正常細胞和腫瘤細胞，如果來自腫瘤細胞稱為循環腫瘤DNA( ctDNA)。但血液遊離DNA片段通常較短，在晚期癌症患者血液中濃度極低，平均約為17g/L 。

既往系列研究已經在NSCLC患者的血漿或血清樣本ctDNA中發現EGFR基因突變，初步顯示外周血ctDNA EGFR基因突變檢測及對EGFR-TKIs療效預測的可行性。IPASS研究通過擴增阻滯突變系統( amplification refractory mutation system，ARMS)方法檢測日本亞組人群血清遊離DNA的EGFR基因突變狀況與臨床療效的研究數據顯示，血清遊離DNA EGFR基因突變陽性患者接受吉非替尼治療較標準化療患者疾病無進展生存期(PFS)顯著延長。IFUM研究也提供了在高加索人群中基於血漿遊離DNA檢測（ARMS檢測）發現的EGFR基因突變陽性患者接受吉非替尼治療NSCLC的療效證據，在腫瘤組織陽性（此組包括血漿陽性與陰性患者）、腫瘤組織和血漿標本均陽性及腫瘤組織陽性而血漿標本陰性三組中，其客觀緩解率分別為70%、76.9%和59.5%。在FASTACT-Ⅱ研究中，血漿EGFR基因突變患者接受厄洛替尼與化療聯合治療的客觀緩解率（74.6%與19.7%）和無進展生存期均優於單獨化療組。而230例中國晚期NSCLC組織與血漿遊離DNA配對分析等研究同樣顯示血液標本EGFR基因突變對於預測靶向藥物治療的臨床獲益與組織突變者高度一致。

與腫瘤組織相比，ctDNA中EGFR基因突變檢測具有高度特異性（IPASS、IFUM和IGNITE研究中的特異度分別為100%、99. 8%和97. 2%），但敏感度相對較低（分別為43. 1%、65. 7%和49. 6%）；這可能與腫瘤分期、血液標本的處理、檢測方法差異等相關。這些特定技術下的血液EGFR基因突變檢測的低敏感度提示在臨床實踐中應高度關注單一血液檢測結果的假陰性情況。

歐洲藥品管理局2014年9月已批准當難以獲取腫瘤組織樣本時，可採用外周血ctDNA作為補充標本評估EGFR基因突變狀態，以明確最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。CFDA在2015年2月已批准吉非替尼說明書進行更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應進行EGFR基因突變檢測基礎上，補充了如果腫瘤標本不可評估，則可使用從血液（血漿）標本中獲得的ctDNA進行評估，以盡最大可能明確最可能從吉非替尼治療中受益的NSCLC患者。

1．血液EGFR基因突變檢測的標本採集及處理：全血中血漿和血清均能分離出ctDNA，但通過和相匹配的血清樣本比較，血漿中ctDNA有更高的檢出率。血漿cfDNA通常片段較短，且在血液中濃度非常低。抽血後延遲血漿分離會導致血細胞裂解，釋放出基因組DNA(gDNA)至血漿中；大量增加的gDNA會稀釋腫瘤來源的ctDNA，使得突變難以檢出。因此在標本的採集、運輸及儲存過程中，防止遊離DNA的降解是首要考慮的因素；其次，也應防止血液中白細胞的裂解，避免因野生型DNA背景的增加導致ctDNA中的EGFR基因突變無法檢測。

為了採集到最佳血漿標本用於後續提取遊離DNA進行EGFR基因突變檢測，建議使用如下兩種方法之一採集10ml全血並進一步分離血漿：(l)用含有遊離DNA保護劑及防細胞裂解保護劑的專用常溫采血管採集全血後輕搖混勻，常溫(6-30℃)放置不超過5 -7 d；以足夠的離心力將全血充分離心兩次，分離出不含細胞成分的血漿，放置於- 70℃凍存直至DNA抽提，或直接進入DNA抽提步驟。(2)用常規EDTA抗凝管（嚴禁使用肝素抗凝管）採集全血後，兩小時內以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次，分離出不含細胞成分的血漿，放置於- 70℃凍存直至DNA抽提，或直接進入DNA抽提步驟。

考慮到臨床實踐的方便性，建議盡量採用第一種方案採集10 ml全血。血漿分離過程中應注意避免吸人白細胞。

2．血液EGFR基因突變檢測的外周血遊離DNA提取：因ctDNA含量低，為提高EGFR基因突變檢出率，在臨床允許的情況下增加血漿用量，建議使用10 ml全血分離出的血漿(4 -5 ml)。外周血遊離DNA的提取有很多方法，建議採用國家葯監部門批准的、大容量血漿遊離DNA分離試劑盒。

3．血液EGFR基因突變檢測的方法：為了最小化獲得假陰性結果的可能性，推薦使用高敏感度的檢測方法用於ctDNA樣本的EGFR基因突變檢測。

目前，檢測基因突變最常用的方法是擴增阻遏突變系統（ARMS法），歐盟批准用於指導吉非替尼治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法。檢測必須在具有資質的檢測中心進行。檢測方法必須進行嚴格的驗證及質控。檢測試劑須使用經CFDA批准的檢測試劑盒。

本共識專家組也推薦EGFR基因突變檢測應在具有資質的檢測中心進行，檢測方法必須進行嚴格的驗證及質控，檢測試劑須使用經CFDA批准的檢測試劑盒。

基因突變檢測的報告內容應包括檢測結果（建議包括明確的病理診斷及專業的書寫）及對結果的詮釋，且能夠被腫瘤科醫師或其他非病理專業的醫師理解。其他內容應涵蓋患者及標本基本信息、DNA質量、檢測方法、檢測試劑及儀器、相關臨床意義以及在檢測過程中出現的狀況及不確定結果和因素，以供臨床醫師全面參考。檢測報告模板見附件1。

所有專業化EGFR基因突變分子檢測實驗室，通過建立高效率的分子檢測平台，優化流程，從接收標本到發出報告周期，建議不超過3 -5個工作日，以及時滿足臨床的需求。

如前所述，血液檢測EGFR基因突變用於篩選EGFR-TKIs適治患者是對組織檢測的重要補充。血液檢測還可以動態監測靶向治療過程中腫瘤標誌物變化，特別是可用於發現新出現的耐葯相關基因變異。

血液檢測用於診斷晚期NSCLC有望實現，但診斷早期NSCLC有待檢測技術不斷的發展和進步。已有很多血液EGFR基因突變檢測的方法的報道，如高分辨熔點曲線分析法(HRM)、變性高效液相色譜技術( DHPLC)、突變擴增阻滯系統(ARMS)法、二代測序、數字PCR方法等.不同血漿遊離核酸EGFR基因突變檢測方法各有優勢和劣勢，但目前成熟且最常用的檢測血液EGFR基因突變的方法是ARMS法，相較腫瘤組織EGFR基因突變檢測，該方法檢測血漿EGFR敏感型基因突變的敏感度在65% - 75%，特異度在98% - 100%。數字PCR在血漿EGFR基因突變檢測上具有較高的靈敏度和特異度，但目前報導的該方法檢測EGFR基因突變位點相對有限（19外顯子缺失，21號外顯子L858R突變以及20號外顯子T790M突變），仍處在摸索、累積經驗階段；其對操作人員和環境均有較高的要求，未來應用於臨床尚需大規模臨床數據驗證。以二代測序技術(NGS)為代表的新技術拓展了基因突變檢測的深度和廣度，但其臨床轉化應用需要更多的數據積累。

未來，期待通過多元化基因檢測平台及技術的不斷發展與成熟，血液驅動基因突變檢測可實現從定性到定量檢測、從靜態至動態檢測、從單基因到多基因、基因組／外顯子組檢測的轉變，從而推動NSCLC精準靶向治療的不斷進步。

當腫瘤組織難以獲取時，血液是EGFR基因突變檢測合適的替代生物材料，也是對可疑組織檢測結果的補充；血液EGFR基因突變檢測可用於對肺癌分子分型、療效預測和疾病監測；目前成熟且最常用的血液EGFR基因突變檢測方法是ARMS法；但是當腫瘤組織可以獲取時，腫瘤組織仍應是優先選擇的生物樣本用於基因狀態分析。隨著檢測技術的不斷發展，期望在保證現有的檢測特異性和預測準確性的基礎上．不斷提高血液EGFR基因突變檢測的靈敏度，有助於整體上提高我國肺癌患者EGFR基因突變受檢率，從而使更多的患者接受精準靶向治療。NSCLC患者EGFR基因突變檢測流程見圖1。

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