PCR技術的前世今生

來自專欄生物科研

「進化」一詞並不陌生，但從哪說起呢？

小朋友們看數碼寶貝時知道了，

太一要想打敗更強大的數碼怪獸需要

亞古獸進化、超進化甚至究極進化；

同學們從達爾文那聽說了，

人類為了適應地球環境的變化，

通過幾千年的演變、進化，

獲得了與當今時代契合的形體與頭腦。

眾所周知，人類的進化需要一個漫長的過程，是以肉眼不可見的速度推進，而技術的革新著實是有目共睹的。一個人的壽命在人類進化史上短的可憐，但如此短暫的時間卻可以讓技術得以翻天覆地的變化。 《華爾街日報》著名作者拉里?唐斯在《顛覆定律》中指出：「技術呈指數變化，但社會、經濟和法律制度僅僅在逐漸變化。」

那麼具體的，技術是如何變化的呢？小諾也將以PCR技術為例，為大家概括PCR技術的「進化簡史」。

PCR「進化簡史」

20世紀80年代，第一代傳統的PCR技術被發明出來，這一方法成為生命科學研究領域中最基礎和最常規的實驗方法之一，通過採用瓊脂糖凝膠電泳的方法來對PCR產物進行分析，但這一方法主要適用於定性和半定量研究。

在20世紀90年代初出現了第二代的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技術，通過在反應體系中加入熒光染料，檢測反應中發出的熒光信號達到閾值的循環數即循環閾值（cycle threshold，Ct）來計算目的酸序列的含量。qPCR技術因其快速、簡易和經濟的特點，目前仍被各實驗室廣泛地使用。但qPCR技術所謂的「定量」仍然是相對的，依賴於Ct值和標準曲線。qPCR在目的序列含量低、表達量差異十分微小、 反應體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。

在這種背景下，第三代PCR——數字PCR（digital PCR，dPCR）應運而生。

dPCR技術將如何操作？

dPCR的操作原理並不複雜。首先，dPCR把反應體系均勻分配到大量反應單元中，每個反應單元中不包含或包含一個到多個目的核酸序列，目的核酸序列的數量符合泊松分布。然後在每個反應單元中獨立地進行PCR擴增。擴增結束後， 檢測每個反應單元的熒光信號，最終根據泊松分布和熒光信號陽性的反應單元占所有反應單元的比例來計算目的核酸序列的拷貝數。在dPCR反應中熒光信號的產生過程基本與qPCR相同。

dPCR技術將帶來哪些優勢？

高靈敏度

dPCR本質上將一個傳統的PCR反應變成了數萬個PCR反應， 在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。

高精確度

dPCR通過計算在數萬個反應單元中陽性反應單元數量和比例， 可以精確地檢測出變化很小的目的序列差異。

高耐受性

dPCR技術第一步反應體系分配的過程，可以使背景序列和PCR反應抑制物被均勻分配到每個反應單元，而大部分反應單元中並不含有目的序列，低丰度的目的序列被相對富集於某些反應單元中，從而顯著地降低了這些反應單元中背景序列和抑制物對反應的干擾。

絕對定量

PCR直接計算目的序列的拷貝數，無需依賴於Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。

數字PCR將火在哪些領域？

稀有突變檢測

在大量野生型基因存在的情況下精準地檢測低含量的突變基因是目前的研究難點之一，競爭性反應嚴重影響突變基因的檢測。而dPCR技術從背景序列中檢測低丰度目的序列的能力和高靈敏度的特點使得這一技術特別適合在複雜背景中檢測稀有突變。

拷貝數變異分析

拷貝數變異（copy number variations，CNV）研究需要極高的定量精度以區別不同拷貝數之間的微小差異，而dPCR具有高精確度的特點，通過精確計定量目標基因與參照基因，並計算它們的比值，從而得到目標基因的拷貝數，對不同拷貝數的分辨精度遠高qPCR和測序。

複雜樣本基因表達檢測

血液、糞便、食品、土壤等樣本中含有大量PCR反應的抑制物，極大地影響 了PCR反應效率。另外，在某些檢測中，難以製備測定標準曲線所需的標準物質。dPCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標準曲線的優勢，使其特別適合於這些複雜樣本中基因表達的準確定量檢測。

來源：諾賽基因

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