CRISPR「魔力」再升級，2017年又創造出了哪些奇蹟？

07-09

作者：子非魚

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寶「剪」鋒從磨礪出！CRISPR的問世確實帶來了基因編輯的黃金時代，編輯人類胚胎、闖入臨床研究、「霸屏」CNS，每一項都足以振奮人心。而2017年CRISPR似乎更具魔力，它以前所未有的精度，可對各種生物體的DNA做出微調。如今，年終盤點季，小編將帶領大家一起回顧一下「魔剪」CRISPR技術在過去一年的「豐功偉績」。

圖片來源：Sketching-Science Twitter

CRISPR的新玩法——微調DNA

CRISPR雖然備受科研者青睞，但它對DNA突變區域「一刀切」的簡單粗暴做法，卻引來了不少微詞。為了實現零副作用這個終極目標，研究者們給CRISPR增添了新技能——微調DNA。

1 不切DNA，照樣也能治疾病

美國沙克生物研究所的研究者開發出一種新型CRISPR-Cas9系統，能在不切開DNA的前提下，對基因進行激活。他們將Cas9酶表達基因插入一個腺相關病毒（AAVs）的同時，利用另一個AAV引入短sgRNA和轉錄激活劑。sgRNA只有14或15個核苷酸，可阻止Cas9切割DNA，並促使其與轉錄激活劑協同作用。

值得一提的是，該系統在多種疾病小鼠模型中實現了「疾病逆轉」，如急性腎臟疾病小鼠模型、1型糖尿病小鼠模型和肌肉萎縮症小鼠模型。這也證實了新CRISPR技術是安全的，不會產生不想要的基因突變。

參考文獻：In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation(DOI:10.1016/j.cell.2017.10.025)

2 自由替換DNA鹼基，精準打靶

2016年，哈佛研究者成功利用CRISPR技術將DNA的C轉化為U，即實現了C·G鹼基對向T·A鹼基對的轉換。而今年同一個研究團隊再次開發出了「新鹼基編輯器」ABE（Adenine Base Editor）實現了C·G向T·A的轉換。

簡單來說，就是一種改造後的TadA酶，將靶DNA鏈中的腺嘌呤（A）轉換為肌苷（I，I可起到類似鳥嘌呤G的作用），然後「誘騙」細胞修復另一條DNA鏈以完成鹼基對的轉換。研究者利用該技術成功逆轉了與遺傳學血色病相關的G-to-A突變。

參考文獻：Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage (DOI:10.1038/nature24644)

3設置「關閉開關」，更好駕馭CRISPR

為了避免CRISPR誤傷友軍，Doudna教授團隊則通過兩種anti-CRISPR蛋白（ACR）——AcrIIC1 和AcrIIC3，以不同的策略來抑制Cas9酶。前者可直接結合到Cas9酶保守的HNH催化域來阻止多種不同Cas9同源DNA切割；後者通過誘導了Cas9的二聚化來阻止Cas9綁定靶向DNA。

另外，他們還發現升級版Cas9蛋白（如eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1）之所以能實現更精準的DNA切割，是因為其負責感知靶向結合準確性的REC3域發生了突變，使得它們結合非靶目標時，更不容易激活它的「剪刀作用」。

參考文獻：A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9

(DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.037)

https://www.nature.com/articles/nature24268#affil-auth

挖掘新技能，CRISPR「瞄上了」RNA

既然CRISPR已將DNA納入囊中，又怎會放過DNA的「近鄰」RNA呢。近期，CRISPR家族就已經磨刀霍霍向RNA了。

1 搶RNAi飯碗，編輯RNA

張鋒研究團隊測試了來自15種不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最終發現LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更強的特異性在靶RNA上切割特定位點，脫靶效應低。另外，他們還找到了Cas13的「死亡變體」，即能結合RNA，卻不能進行切割作用。且該版本的Cas13可通過結合熒游標記來追蹤RNA的軌跡。

參考文獻：RNA targeting with CRISPR–Cas13 (DOI:10.1038/nature24049)

2 篩選lncRNA，CRISPR更方便

研究者研發一種基因組規模的CRISPR-Cas9激活篩選，能夠靶向超過10000 lncRNA轉錄起始點，以識別影響表型的非編碼位點。結果發現有11個lncRNA位點，通過招募激活劑在人類黑色劉細胞中調節對BRAF抑製劑的耐藥性；且大多數候選位點均可調節附近的基因。

因而研究可以通過這一篩選工具，系統性的發現非編碼嗎位點的功能，並闡明它們在基因調控和細胞功能中的多種作用。

參考文獻：Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood (DOI:10.1038/nature24009)

3 首次證實circRNA與大腦息息相關

Cdr1as是哺乳動物大腦中高表達的一種環狀RNA，因其從DNA反義鏈轉錄而來，沒有良好表達的線性等價物，導致其相關功能的分析缺失。

研究者在發現Cdr1as可以和miR-7、miR-671均結合後，則利用CRISPR-Cas9選擇性刪除了小鼠中的Cdr1as基因，結果發現miR-7的水平下調了，miR-671的水平上調了。而且Cdr1as敲除小鼠中與大腦活性相關的「即刻早期基因」（如Fos，且很多為miR-7靶標）的表達發生了變化，而小鼠也表現除了異常的神經元活動。

參考文獻：Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function (DOI:10.1126/science.aam8526)

攻克疾病，CRISPR大有可為

老實說，無論CRISPR靶向是DNA，還是RNA，其最終目的都是為了攻克疾病，將其從人體上徹底驅除出境，還給人們一個健康的機體。

1 挖掘AML白血病新葯靶標

AML作為一種侵襲性血癌，患者的存活率極低。研究者先構建了攜帶人AML細胞可能存在突變的靶基因的小鼠後，利用CRISPR系統性測試每個基因，並發現46個潛在的候選基因（產生修飾RNA的蛋白）是AML細胞存活所必需的。

其中METTL3是具有最強影響的基因之一，且它雖是AML細胞存活所必需的，但卻不是健康血細胞所必需的，因而也就成為了不錯的潛在藥物靶標。

參考文獻：Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent translation control (DOI:10.1038/nature24678

2 牽手CRISPR，打造CAR-T2.0時代

英國的研究者利用CRISPR技術，對殺傷性T細胞進行基因改造，移除它們的非癌症特異性受體，並將這些受體替換為能識別和摧毀特定癌細胞的受體，從而為抵抗一系列癌症提供新的希望。

參考文獻：CRISPR-mediated TCR replacement generates superior anticancer transgenic T-cells (DOI：10.1182/blood-2017-05-787598)

3 變「鈍」的「剪刀」帶來新啟示

眾所周知，離基因編碼區相隔幾萬個鹼基對的增強子是通過嚴格的時空特性對基因進行精確調控，否則基因表達就會發生紊亂。研究者利用CRISPR activation（CRISPRa，可靶向激活DNA序列，而非切割）確定了IL-2RA基因的增強子區域，並發現如果該區域出現故障，則細胞難以起到抑制炎症反應的能力，從而導致自身免疫病的發生。

參考文獻：Discovery of stimulation-responsive immune enhancers with CRISPR activation (DOI:10.1038/nature23875)

4 抑制血管生成，不遺餘力治療眼疾

血管生成可導致視力喪失和失明，是多種退行性眼部疾病的一種特徵。而研究者利用腺相關病毒（AAV）運送靶向VEGFR2的CRISPR系統，可成功阻止視網膜中的血管生成，為以病理性眼球內血管生成為特徵的眼部疾病新療法提供了依據。

參考文獻：Genome editing abrogates angiogenesis in vivo (DOI:10.1038/s41467-017-00140-3)

5 攻克HIV，CRISPR立下一功

研究已經發現，攜有CCR5純合突變的人可抑制HIV侵入免疫細胞。而研究者鄧宏魁教授則利用CRISPR破壞了CD34 HSPC細胞中的CCR5基因，且其基因編輯效率為21%~28%，顯著高於ZFN的編輯效率（17%）。

研究者還將敲除CCR5的細胞移植到小鼠體內後，接觸HIV毒株，發現相比於攜帶正常人HSPC細胞的小鼠而言，HIV RNA水平在感染的最初幾周內發生下降，且CD4 T細胞數量下降得更少。

參考文獻：CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo (doi:10.1016/j.ymthe.2017.04.027)

不務正業？CRISPR的另類畫風

如果你以為CRISPR只能作基因編輯，那麼未免有些小瞧了它。都說能者多勞，這不CRISPR已經再像多媒體領域進軍啦。

1 魔剪親自化身「錄音機」

哥倫比亞的研究者利用巧妙的分子黑客技術，成功地將細菌的免疫系統CRISPR轉化為一種微型數據記錄儀（data recorder），首次記錄了細胞活動及相關事件的時間順序，從而為開發利用細菌細胞進行疾病診斷或環境監測新技術奠定了基因。

研究者合成了兩種特殊質粒，一個表達CRISPR系統元件驅動「錄音」和標記時間的記錄質粒（負責驅動「錄音機」和標記時間），另一個能夠在響應外部信號時產生更多拷貝。現已證實，該系統可以處理至少三種同時發生的信號，並記錄數日。

參考文獻：Multiplex recording of cellular events over time on CRISPR biological tape (DOI:10.1126/science.aao0958)

2 刻錄小視頻，助細胞成為見證者

美國哈佛大學的研究者構建出首個基於CRISPR系統的分子記錄器，並將一部視頻短片（gif 圖）編碼進了大腸桿菌的DNA中。

他們先是將DNA的基本組成（A、T、G、C）生成代碼，並將每個代碼關聯圖片的單個像素。其次，將gif序列逐幀傳至活細菌，並按傳輸順序插入細菌基因組中，隨後這些數據就可通過測序DNA重新被提取出來，通過讀取像素核苷酸代碼，可將圖片以90%的精確度重構出來。

參考文獻：CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria. (doi:10.1038/nature23017)