做實驗 | 做好這幾步，分分鐘成為WB達人！

來自專欄東澳生物

在做WB實驗時總會遇上這樣那樣的問題，比如WB檢測信號弱、檢測不到條帶、背景深等，其實嚴格按要求做，控制好實驗中的幾個關鍵步驟，分分鐘搞定WB~

蛋白樣品的製備與定量

好的蛋白是成功的一半

1.提細胞蛋白

（1）消化或刮下細胞至1.5的EP管中，標記，10000r離心2min，PBS洗3遍

（2）吸去EP管中PBS，最好用濾紙吸干裡面的水分，加適量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋白酶抑製劑=250:1），如果你想做信號通路指標還得再加上磷酸酶抑製劑（磷酸酶抑製劑：RIPA裂解液=1:1000）

（3）冰上裂解30min~1h，開4°離心機

（4）4°離心11000r，20min

（5）測蛋白濃度，取上清，加蛋白上清的四分之一體積5x上樣loading buffer，煮沸，分裝（蛋白質變性）

2.提組織蛋白

（1）研缽中倒入液氮，加入組織塊，研磨，加液氮，葯匙刮

（2）刮下後放入1.5ml的EP管，加適量裂解液，吹打

（3）冰上放置1h，期間，每隔10~15min吹打一次，開4°離心機

（4）4°離心10000r，1h

（5）測蛋白濃度，取上清，加1/4體積5x loading buffer，煮沸，分裝

3.測蛋白濃度（BCA法）

（1）八個標準孔，按說明書先加超純水，再加標準蛋白液

（2）目的孔，每孔加18ul超純水+2ul目的蛋白

（3）按說明書配BCA工作液，每孔加200ul

（4）37°放置半小時後測濃度

4.計算上樣量，設計上樣順序

上樣體積：上樣量/濃度x 5/4

上樣順序：無處理，對照，處理；體積最好不要相差太大

經驗總結：

• 如何提高蛋白濃度：首先當然是多種點細胞啦，其次可以少加點裂解液，盡量裂解充分。
• 如何處理蛋白濃度低的問題：實驗過程中發現蛋白的濃度太低，如果上樣的話，體積太大，甚至電泳孔都裝不下，舉例：假設我需要上樣40ul才能達到20ug，那麼顯然按照常規的方法，10孔的梳子只能加25ul左右，我們此時可以取40ul蛋白入EP管中，放置於PCR儀器，變性溫度濃縮蛋白體積，這樣不斷濃縮之後促使EP管中蛋白的水分降低，蛋白量依舊是20ug。
• 如何保證對照組和實驗組蛋白濃度大概是一致的：種植細胞的時候盡量保持鋪下去的細胞數接近，收細胞之後觀察細胞的多少適當加入幾倍體積的裂解液。

電泳

（1）清洗玻璃板，去離子水沖，風乾或烤乾（一定要以處女座的精神去嚴格要求自己把板子洗乾淨，相當重要）

（2） 按說明書配膠。先配下膠（分離膠），一般兩塊板配10ml的10%的膠（20~80kDa通用）膠的濃度根據你所需要跑的蛋白的分子量大小決定,混勻後灌膠，立即用正丁醇或無水乙醇封，待凝固後倒出正丁醇，用去離子水沖洗，濾紙吸干

（3）配上膠（積層膠），參考說明書，一般兩塊板配4ml的5%的膠，混勻後灌膠，插板,待凝固。（可4°過夜）

（4）配電泳液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，SDS1g，定容至1L）

（5）將玻璃板裝好放入電泳槽中，加電泳液，輕輕拔梳。

（6）上樣（這是每個WB達人最能裝逼的一個環節，高手會告訴你憑感覺加樣連孔都不用看）

（7）連接電源，一定要注意紅對紅，黑對黑，定電壓和時間，上膠（90v，約40min，maker分出條帶），換壓，下膠（120v，2h）。（不要讓溴酚藍跑出去）

經驗總結：

• 想要條帶跑的好看點，最好把上膠稍微配高一點。
• 換電壓主要是看溴酚藍有沒有跑到下膠，沒有確定的時間點
• 膠最好現配現用，如果需要保存最好用濕潤的保鮮膜包好

轉膜

整個WB過程中最重要的環節

（1）跑到溴酚藍距離最下緣25px時配電轉液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇100ml，定容至1L）

（2）在電轉液中剝膠，裁膠，剪膜，膜活化（甲醇1min，去離子水1min，電解液15min）

（3）「三明治」黑板~海綿~三層濾紙~膠~膜（正面朝下，分清左右，與膠對應）~3層濾紙~海綿~白板，夾緊後放入電轉槽中。（海綿，濾紙，膜需浸潤透，過程中不能幹，趕趕氣泡）

（4）連接電源，一定要注意紅對紅，黑對黑，定電流和時間（150mA，1h，若分子量大於90，再加200mA，2h）具體情況具體分析

經驗總結：

• 溴酚藍跑到最終的距離是根據你所需要切的分子量決定的，假如你就只需要切一條ACTIN(43Kda)這樣的，你完全只需要跑到下膠，看到差不多marker分開了就可以切膠了。假如你要從最上到最下切好多條出來，你則需要把溴酚藍盡量跑到最下面，這樣marker容易被跑開，有利於切膠。

• 濾紙和PVDF膜的裁剪必須要整齊，乾淨，標記清晰。
• PVDF膜型號的選擇要正確。如正常的30~170kDa的分子一般需要孔徑0.45mm的膜就足夠了。太小的則需要選擇孔徑為0.22mm的膜。
• 關於轉膜是否要加SDS的問題。SDS帶負電，加SDS一般是針對那些分子量大的WB，加入SDS可以增加分子導電性，這樣更利於轉膜。
• 關於轉膜電流，分子是否能夠轉過去和轉膜時間沒有必要關係，而更在於轉膜電流的大小。舉個例子，200kDa的分子量，你用90mAh就算轉一年都轉不過去。

免疫印跡

（1）膜處理（甲醇1min，風乾（放濾紙上），甲醇1min，水1min）

（2）封閉（用TBST配5%牛奶）1h配搖床

（3）加一抗，牛奶稀釋,所需濃度參考抗體說明書，看膜的大小配多少一抗，4°過夜。

（4）室溫孵育20min

（5）0.1%TBST洗10min x 3次配搖床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl至PH7.6後定容至1L後，加入1ml的TWEEN20）

（6）加二抗，牛奶稀釋，一般1:10000，1h配搖床

（7）0.1%TBST洗10min x 3次配搖床

（8）發光（A液B液等體積混合，孵膜1min，正面朝上放入儀器內發光）

經驗總結：

• 封閉液的選取具體得看抗體說明書，有的抗體是明確要求只能用BSA，而且封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況5%BSA的效果會比5%牛奶要好。
• 信號通路一般都是用5%BSA封閉。
• 信號通路在洗膜的時候用快速搖床5min/次 3次就可以了。
• 如果你想省時間，一抗可以放在37℃1~2hour，但是一定要封好，以免溫度太高而導致抗體幹了出現假陽性。二抗可以37℃半個小時。
• 發光液的選取，如果是一般的抗體，建議用一般的發光液效果會好一點，如keygen的，背景會比較乾淨。但是一些難發出來的一般建議用靈敏度更高的發光液如FD的或者是MILLIPORE之類的發光液。

結果分析

1微笑條帶

解析：由於凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現於較厚的凝膠

處理辦法：配膠時一定要充分混勻，待其充分凝固後再做後續試驗

2帶出現紋理現象

解析：樣品不溶性顆粒

處理辦法：加樣前最好是離心一下樣品

3電泳條帶粗

（這是個內參β-actin）

解析：蛋白樣品沒有濃縮，量太大

4條帶出現好多洞洞

解析：轉膜的時候沒有把三明治里的氣泡幹掉

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