2017，最優質的CRISPR基因編輯技術突破盤點

動物形象：CRISPR

導 讀

CRISPR基因編輯技術，用任何讚美字詞去稱讚它都不為過。它為人類打開了新世界的大門，也開啟了人類編製生命之網的歷程。那麼在過去的2017年，到底誕生了哪些優秀的成果呢？

2003年的一個悶熱的下午，正在度假的西班牙微生物學家Francisco Mojica告訴他的妻子，他不打算回家了。多年來， Mojica一直在從事CRISPR研究，引導他進入這個研究領域的是一次偶然的發現：一個神秘的細菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。

這個不歸家的下午，後來成就了超過2000篇的文章，其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等頂級期刊的發表的文章。

Mojica博士和同事們偶然發現了一種古老的細菌性免疫防禦系統，可以儲存病毒的基因密碼，如果將該系統比作警察，那它手裡就有罪犯——病毒DNA的照片，那麼任何之前侵略過該細菌的病毒會被立馬清除出去。

這一發現可不可以被用於編輯其他基因呢？可以。

2012年， Emmanuelle Charpentier博士（柏林感染生物學Max普朗克協會的成員）和Jennifer Doudna博士（伯克利大學霍華德休斯醫學研究所的教授）的合作，證明了CRISPR系統（使用一種名為Cas9核酸酶）作為一種有效的基因編輯工具，能夠定位和切割幾乎任何DNA序列。

現在張鋒博士和George Church博士如果能夠證明CRISPR/Cas9可以編輯人體內的基因，那麼生物技術的革命暴風雨，將瞬間席捲全世界。

在過去的6個月中，我們看到了人類胚胎致病基因編輯的重大進展，包括基因編輯工具的拓展：RNA編輯器、CRISPR系統和超精密的基礎編輯系統。

那麼在2017年，有哪些巔峰的CRISPR編輯系統的進展，值得我們在這一年的年尾反覆回味呢？

1.Malorye Allison Branca——CRISPR系統將改變臨床的格局

2017年2月份，《Nature》子刊指出CRISPR編輯與測序技術相結合，可以大大提升遺傳篩查的效率。

3月份，《Nature》發表斯隆凱特林癌症紀念中心的論文，利用CRISPR編輯構建強效CAR-T細胞研究論文，實現腫瘤的超強殺滅效果。

而如果說起基因編輯技術，就不得不提中國。2016年10月四川大學的Lu You教授第一個進行了CRISPR實驗，他在肺癌患者的肺中注入能夠降低PD-1活性的免疫細胞。雖然實驗結果有效性被頗多人質疑，但是毫無疑問，這是一項創舉。

CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前廣泛使用的基因編輯系統。目前來看，CRISPR臨床前研究的結果振奮人心，例如血友病、杜氏營養不良症、眼部疾病或是甲狀腺素運載蛋白澱粉樣變性的治療。

隨著CRISPR基因編輯的技術發展，其應用於臨床的前景必將無比寬闊。

2.DeeAnn Visk博士——基因編輯系統的裝備庫

擴大CRISPR/Cas9的規模需要進行相關的結果驗證。最簡單的方法就是設計相關的基因庫或檢測試劑盒，使得CRISPR/Cas9越來越成熟。

Vermeulen博士對CRISPR/Cas9進行多組實驗後發現，CRISPR編輯技術可以永久修改基因組DNA而不是暫時改變RNA的表達水平。DNA的合成能力近年來突飛猛進，研究人員能合成更長的DNA並且可以進行質粒的組裝，從而簡化CRISPR基因庫的製備。

ATI可以用來評估CRISPR誘發突變的細胞系。通過使用高活性的T7核酸內切酶及相應儀器可以加快CRISPR的實驗進程。長片段的PCR擴增技術已被高度選擇性的T7 DNA酶所取代。含有綠色熒光蛋白（GFP）標記的啟動子可以解決二倍體細胞系中兩個DNA突變鑒別的問題。這種標記可以用來評價細胞中被替換基因的啟動子強度。

3.Kate Marusina博士——懷疑論者的「毀滅帝」

在人類的感覺器官中，最容易受損的就是聽力，而超過50%是遺傳導致的。

為了對此進行研究，科研人員利用斑馬魚進行試驗。聽力受損的斑馬魚表現出一種特徵性的循環遊泳行為，以此來與野生型進行區分。研究人員利用基因編輯技術和轉錄激活因子核酸酶（TALENs），使得隱性純合子的胚胎表達降低。而這個結果，大大減少了斑馬魚的遺傳性聽力損失。

4.MaryAnn Labant——基因編輯造福器官移植

利用CRISPR/Cas9技術，人類可以解決跨物種移植這個難題，解決人體組織器官的嚴重短缺。考慮到倫理和兼容性，器官移植一開始把重點放在豬的器官上。然而，1997年發生的豬內源性逆轉錄病毒事件使得全球禁止進行豬器官的移植，人類將所有的希望集中在轉基因豬上。隨後科學家在PK15豬腎上皮細胞上進行了相關實驗根除了豬內源性逆轉錄病毒。

Milliporesigma公司推出了各種CRISPR產品，為廣大科研人員服務。milliporesigma和威康信託基金桑格研究所經過兩年的合作，開發出了第一個基因組文庫篩選系統，從而減少了實驗的時間。

5.MaryAnn Labant——基因編輯路在何方

CRISPR-Cas9基因編輯系統相較於經典的基因治療所需時間更短，且基因組編輯組件可以被載入到病毒載體中，加速臨床開發。早期的基因組編輯使用的是鋅指核酸酶的方法（ZFN）。而CRISPR-Cas9的出現為基因編輯注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性，例如靶向性和特異性。CRISPR目前只是用來輔助治療CAR-T細胞以增強其療效。

那麼現在，CRISPR基因編輯技術可以用來做什麼？

基因組CRISPR篩選識別調控蛋白

利用CRISPR進行遺傳篩選可以控制相關遺傳物質。研究人員構建了由同一啟動子表達的綠色熒光蛋白（GFP），然後在其中一組的細胞啟動子和GFP之間插入了目標基因調控元件，另一個組則沒有。在幾個不同的時間點通過對兩組細胞進行流式細胞儀分離細胞，檢測相應的熒光強度。通過這一實驗，我們能夠篩選人類蛋白編碼基因，並確定負責調控相關蛋白的調節基因。

CRISPR/Cas9能夠加快HIV的篩查

和治療

多年來，高通量陣列基因組篩選技術一直是探究生物相關通路的標準，用來研究相應的生物學機制。CRISPR/Cas9的基因敲除技術具有高通量檢測的優勢，它能轉化CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）與CRISPR RNA Cas9蛋白的合成和引物RNA。這項研究的重點是確定艾滋病毒感染的新靶點。通過表型、基因編輯率和基因敲除等方法驗證了研究方法的準確性。作者在排除了幾個宿主因子的影響後，證實了預期的表型，發現了新的基因靶點。因此，他們展示了利用CRISPR基因敲除篩選方法來確定HIV發病與新感染宿主之間的關係。

克服克隆篩選的瓶頸

CRISPR / CAS系統的瓶頸在於對含有致突變和雜合性的克隆體的測序。雖然可以用篩選方法加以解決，但成本和時間大大增加。目前，科學家們正在轉向低成本的篩選方法。AATI已經開發出一個強大的T7核酸內切酶法，能夠與片段分析儀無縫集成，用來對CRISPR基因編輯的精度進行測定。

高度特異的基因組編輯：

alt-r S.P. HIFI Cas9核酸酶3nls

許多研究者關注的一個問題是CRISPR/Cas9系統潛在的脫靶效應。通過對alt-r CRISPR-Cas9 系統-alt-r化膿性鏈球菌HIFI Cas9核酸酶3nls進行高效基因組編輯後，其基因編輯效率和精度都大幅提升。IDT的科學家利用Cas9核酸酶使該系統變成更精確的基因組編輯工具。通過對250000多個突變體進行實驗後，他們認為這種酶能有效解決脫靶現象的發生。它的優越性能已經得到了許多實驗室的驗證，這些實驗室對各種生物系統進行了相應的轉化研究。

1型糖尿病小鼠模型

傑克遜實驗室的模型建立服務（MGS）團隊已經廣泛使用CRISPR技術創造轉基因小鼠，他們建立的模型是B淋巴細胞的類開關重組突變體，這在研究1型糖尿病的發展中至關重要。研究人員使用經CRISPR處理過的雙陰性Aidca基因小鼠與野生型小鼠進行比較，雙陰性Aidca基因小鼠的1型糖尿病發病率更低。結果表明利用CRISPR 技術修改Aidca基因能夠顯著降低1型糖尿病的發生率。

CRISPR轉染技術治療

多個單基因突變的艾滋病的發展

CRISPR是一個突破性的技術，但無論是在基礎研究中或作為一種治療劑，CRISPR基因編輯都必須進入相關的細胞群中才能發揮作用。因此在更為複雜的研究或是臨床研究中，CRISPR轉染細胞往往比較困難。MaxCyte是基於流式電穿孔技術的基因編輯器，它具有轉染效率高和細胞存活率高的特點。

加快分析CRISPR/Cas9

產品自動化編輯效率的測量

利用CRISPR/Cas9進行精確的基因修飾需要強大的分析工具來驗證目標是否突變成功，並測量實驗的效率。傳統的CRISPR/Cas9分析的瓶頸是難以處理大劑量的樣品。經典分析方法費時費力，不適於高通量分析。PerkinElmer晶元實驗室的GX核酸分析儀採用相關的微電流技術，減少了樣本測序的數量，大大縮短時間。

代理CRISPR實驗

Milliporesigma具有高效的研發CRISPR功能實用性的能力。MilliporeSigma能使不具備DNA切割活性的dspCas9突變並將它放置在CRISPR系統附近，使其產生巨大的DNA切割活性。CRISPR代理實驗可以提高三個方面的內容：（1）提高基因組編輯的能力，包括基因敲除和插入；（2）增加靶向性，成倍增加目標基因的靶向性；（3）降低目標基因的切割頻率。

在更為自然的生物環境中

進行蛋白質生物學研究

標記序列常常被整合到表達蛋白中，從而對蛋白質的功能進行鑒定。然而，許多大尺寸的標記物插入效率低，並且檢測通常僅限於抗體層面，導致這些方法使用受限。Promega公司的科學家們通過一種11個氨基酸的肽標籤敏感的生物發光檢測方法，來克服CRISPR編輯的局限性。

我們已經不再為CRISPR編輯系統的突破感到驚訝，衷心希望這個領域的突破可以儘快推動到臨床，幫助人類真正戰勝各類遺傳病。

參考資料：Supplement: Best of CRISPR 2017

Peak CRISPR: On the Cusp of a Biomedical Revolution

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