CRISPR/Cas9技術詳解，簡單易懂

10 6月 【熱點科普】五分鐘看懂CRISPR/Cas技術 Posted at 09:12h in 技術前沿, 生物資訊 by ScienceLondon 0 Comments

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最熱門的基因編輯技術CRISPR/Cas9勢必會帶來生物研究的革命。只需五分鐘，本文將帶你快速入門CRISPR/Cas9技術，了解它的工作原理和應用，以及CRISPR技術的最新突破。

前言

6月2日，Science雜誌發表了關於CRISPR技術的突破性成果，確定了一個靶向RNA而非DNA的新型CRISPR系統特徵。來自麻省理工學院-哈佛大學Broad研究所、麻省理工學院、美國國立衛生研究院、羅格斯大學新布朗斯維克分校和俄羅斯Skolkovo理工學院的研究人員共同取得了這項研究成果，擁有「CRISPR/Cas之父」之稱的著名科學家張鋒也是這項研究的主導者之一。這再次讓CRISPR技術成為了人們矚目的焦點（最新論文PDF請見附件abudayyeh2016.pdf）

CRISPR/Cas這項明星技術自問世以來，已經吸引了無數歡呼和掌聲。在短短兩三年之內，它已經成為了生物科學領域最炙手可熱的研究工具，並有近700篇相關文獻發表。CRISPR/Cas技術的先驅者們，包括張鋒以及兩位美女科學家珍妮弗·杜德娜和艾曼紐·夏邦傑，更是獲得了眾多榮譽和獎項。

那麼，獲得科研人員們如此青睞的CRISPR/Cas技術究竟是什麼？它的原理是怎樣的？張鋒博士的新突破又是什麼？本文將帶您快速了解CRISPR/Cas技術的原理與應用。

CRISPR/Cas技術是什麼？

CRISPR/Cas系統是一種原核生物的免疫系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，比如噬菌體病毒和外源質粒。同時，它為細菌提供了獲得性免疫：這與哺乳動物的二次免疫類似，當細菌遭受病毒或者外源質粒入侵時，會產生相應的「記憶」，從而可以抵抗它們的再次入侵。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA，並將它們切斷，沉默外源基因的表達。這與真核生物中RNA干擾（RNAi)的原理是相似的。正是由於這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統被開發成一種高效的基因編輯工具。在自然界中，CRISPR/Cas系統擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統是研究最深入，應用最成熟的一種類別。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。憑藉著成本低廉，操作方便，效率高等優點，CRISPR/Cas9迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手。在TALEN和ZFN的時代，科學家們往往要花費重金，把基因編輯工作交給生物公司。而現在，在實驗室里，人們就可以使用CRISPR/Cas9技術輕鬆的實現基因編輯。

CRISPR/Cas9如何工作？

CRISPR簇是一個廣泛存在於細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重複序列家族，充當了防禦外源遺傳物質的「基因武器」。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規律間隔的短迴文重複序列，分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古細菌當中。圖1展示了完整的CRISPR位點的結構。其中，CRISPR序列由眾多短而保守的重複序列區（repeat）和間隔區（spacer）組成。重複序列區含有迴文序列，可以形成發卡結構。而間隔區比較特殊，它們是被細菌俘獲的外源DNA序列。這就相當於細菌免疫系統的「黑名單」，當這些外源遺傳物質再次入侵時，CRISPR/Cas系統就會予以精確打擊。而在上游的前導區（leader）被認為是CRISPR序列的啟動子。另外，在上游還有一個多態性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（CRISPR associated，Cas）。目前已經發現了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。Cas基因與CRISPR序列共同進化，形成了在細菌中高度保守的CRISPR/Cas系統。

圖1：CRISPR位點結構圖

那麼，CRISPR序列是如何與Cas蛋白配合來執行防禦功能的呢？整個過程大體分為3步。

1.外源DNA俘獲：「黑名單」登記

簡單來說，CRISPR/Cas系統在這一步實現了一個「黑名單登記」功能。序CRISPR/Cas系統將識別出入侵者的「名字」（PAM）並找到它的「身份證」（原間隔序列），然後把入侵者身份信息作為「檔案」（間隔序列）記錄到「黑名單」（CRISPR序列）中。圖2展示了第一階段的工作原理。當噬菌體病毒首次入侵宿主細菌，病毒的雙鏈DNA被注入細胞內部。CRISPR/Cas系統會從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的「身份證」，然後將其作為新的間隔序列被整合到基因組的CRISPR序列之中。因此，這段與間隔序列對應的「身份證」被稱為原間隔序列（protospacer）。然而，「身份證」的選取並不是隨機的。原間隔序列向兩端延伸的幾個鹼基都十分保守，被稱為原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三個鹼基構成（N為任意鹼基）。病毒入侵時，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。隨後，Cas1/2蛋白複合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。然後，DNA會進行修復，將打開的雙鏈缺口閉合。這樣一來，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中。

圖2：第一階段：外源DNA俘獲

2. crRNA合成：」軍火「製造

戰爭總需要武器，CRISPR/Cas系統也要製造足夠的」軍火「來打擊入侵者。目前的研究表明，CRISPR/Cas系統共有三種方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）來製造」軍火「。CRISPR/Cas9系統屬於Type Ⅱ，是目前最成熟也是應用最廣的類型。因此，圖3將重點介紹CRISPR/Cas9的原理。當入侵者到來，CRISPR序列會在」指揮官「（前導區）的調控下轉錄出兩種「軍火材料」：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重複序列區轉錄而成的具有發卡結構的RNA，而pre-crRNA是由整個CRISPR序列轉錄而成的大型RNA分子。隨後，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9編碼的蛋白將會組裝成一個小型「兵工廠」。它將根據入侵者的類型，選取對應的「身份證」（間隔序列RNA），並在RNase Ⅲ的協助下對這段間「身份證」進行剪切，最終形成一段短小的crRNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重複序列區）。crRNA，Cas9以及tracrRNA組成的複合物，就是最終的「戰鬥武器」。

圖3：第二階段：crRNA合成

3.靶向干擾：強大火力，精確打擊

武器已經製造完成，戰爭就要打響。圖4展示了靶向干擾的過程。Cas9/tracrRNA/crRNA複合物就像是一枚制導導彈，可以對入侵者的DNA進行精確的打擊。這個複合物將掃描整個外源DNA序列，並識別出與crRNA互補的原間隔序列。這時，複合物將定位到PAM/原間隔序列的區域，DNA雙鏈將被解開，形成R-Loop。crRNA將與互補鏈雜交，而另一條鏈則保持遊離狀態。隨後，Cas9蛋白髮起猛烈攻勢，其HNH酶活性將剪切crRNA互補的DNA鏈，而其RuvC活性位點將剪切非互補鏈。最終，Cas9強大的火力使雙鏈斷裂（DSB）形成，外源DNA的表達被沉默，入侵者被一舉殲滅。

圖4：第三階段：靶向干擾

如何應用CRISPR/Cas技術？

CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。在嚮導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。但是，CRISPR/Cas9的應用也有一些限制條件。首先，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（NGG）。其次，嚮導RNA要與PAM上游的序列鹼基互補配對。圖5展示了最基礎的兩種CRISPR/Cas9技術應用。最基礎的技術就是基因敲除。如果在基因的上下游各設計一條嚮導RNA（嚮導RNA1，嚮導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，嚮導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒（供體DNA分子），這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。這樣就可以實現基因的替換或者突變。對受精卵細胞進行基因編輯，並將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術已經被廣泛的應用。除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，它還可以被用於基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。

圖5：CRISPR/Cas9技術應用

張鋒博士的最新突破是什麼?

這是一項複雜的研究，但是我們簡單來說，研究人員們發現了一個新興CRISPR系統。事實上，除了CRISPR/Cas系統，CRISPR系統的類型眾多。Cas9僅僅是其中一類作用蛋白，CRISPR序列理論上還可以跟許多其它蛋白共同作用。但是長期以來，這些系統並未被驗證可以進行有效的基因編輯。CRISPR/C2c2就是張鋒博士的團隊最新發現的可以被用作基因編輯的CRISPR系統。圖6展示了這個系統的工作模型。這個系統的突破性意義就在於它可以在RNA級別進行編輯，而不是傳統的DNA級別的編輯。該系統基本的工作流程與CRISPR/Cas9類似，還是藉助CRISPR序列的」黑名單「系統對入侵者進行打擊。但是crRNA形成的方式與CRISPR/Cas9系統不同。C2c2蛋白會與成熟的crRNA複合，在不藉助tracrRNA的情況下與外源單鏈RNA結合，crRNA則會與PFS片段（類似PAM）附近的互補區域雜交。最後，外源單鏈RNA會被剪切，其基因表達也會被沉默。然而，被剪切的外源RNA有可能會觸發宿主細胞RNA的剪切，從而引入宿主細胞凋亡機制。這種只靶向作用於RNA並協助執行基因組指令的能力能夠讓人們特異性地和高通量地操縱RNA，以及更加廣泛地操縱基因功能。這有潛力加快理解、治療和預防疾病的步伐。 張鋒博士說，「C2c2為強大CRISPR工具的一個全新領域打開大門。對C2c2而言，它有大量的可能性，而且我們興奮地將它開發為一種用於生命科學研究和醫學的平台。」

圖6：選自C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.

參考資料

Cater, J. and Wiedenheft, B.(2015) .Snapshot：CRISPR-RNA-guided adaptive immune system. Cell.163(1): 260-260.

Jackson, R.N., and Wiedenheft, B. (2015).A conserved structural chassis for mounting versatile CRISPR RNA-guided immune responses.Mol. Cell. 58, 722–728.

Abudayyeh, O. O. et al.(2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. aaf5573.

張鋒Science文章：靶向RNA的新型CRISPR系統http://www.ebiotrade.com/newsf/2016-6/201661155130939.htm

從基因編輯狗談CRISPR/Cas9 http://www.bioon.com/trends/news/615569.shtml

Ledford, H. (2015). CRISPR, the disruptor. Nature. 522(7554), 20-24.

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