探討人蔘及西洋參栽培土壤微生物種群結構的遺傳多樣性-醫學論文網

　　1 引言 　　　　人蔘（Panax ginseng C. A. Meyer）系我國傳統名貴中藥材，具有強烈的忌連作特性，栽過人蔘的土地（俗稱老參地）30～40年內無法重茬栽參，否則易出現嚴重的燒須、爛根、病害高發等問題，嚴重者甚者造成絕收。針對人蔘連作障礙問題，前人從土壤理化性狀[1]、營養成分[2,3]、土壤微生物生態[4]、病菌積累[5]、化感作用[6]等方面開展了大量而深入的研究，但其形成及作用機制迄今尚不明確。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，其在物質與能量循環、土壤結構保持、土壤微生態平衡等方面發揮重要作用[7]。土壤微生物種群多樣性是評價土壤微生態環境變化的重要指標，開展與人蔘連作障礙以及與人蔘土傳病害密切相關的老參地土壤微生物種群結構研究，對於闡明土壤微生物種群遺傳多樣性在土壤微生態平衡保持中的作用意義重大。　　土壤微生物傳統分析方法建立在菌物培養的基礎上，受多種因素制約，可培養的微生物僅占土壤微生物總數的極小比例（約1%～5%）[8,9]。藉助傳統的菌物培養方法難以真實、客觀地反映土壤微生物種群結構。隨著科學技術的進步，許多基於高通量組織培養（如：BIOLOG）、化學分析（如：PLFA）以及PCR擴增（如：DGGE、T-RFLP）等現代生態學研究方法不斷湧現，並成功應用於土壤微生物遺傳多樣性、物種鑒定、系統進化、生態功能分析等研究領域[10-14]。RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是用於土壤微生物種群分析的有效方法之一，其具有操作簡單、費用低廉、通用性好等優點；RAPD引物能夠與土壤微生物基因組DNA特定位點隨機結合，從而達到掃描微生物全基因組的目的。該方法自創建至今，已被廣泛應用於動物、植物及微生物基因組水平的遺傳多樣性研究。　　本研究在前期已經研究的基礎上[15-17]，利用RAPD方法對采自人蔘、西洋參生產基地集的根際土及根圍土微生物種群開展了遺傳多樣性研究；另外，通過比較不同年生人蔘及西洋參根區土壤微生物種群結構差異，探討了人蔘栽培過程中土壤微生物種群結構的特徵性變化，為深入探究人蔘連作障礙的形成機制奠定了理論基礎。　　　2 材料與方法　　　　2.1土壤樣品　　供試土壤樣品共計18份，均采自吉林省撫松縣新屯鎮黃泥村（北緯42°31′54.2″，東經:127°15′45.8″，海拔581.6 m）。供試土壤樣品均為黃土，分別采自人蔘、西洋參的根際及根圍。每份土壤樣品均通過多點取樣獲得，取後直接裝入自封袋，採回土樣隨即進行了土壤微生物基因組DNA的提取，-20℃保存備用。　　2.2土壤微生物RAPD分析　　土壤微生物總DNA提取及RAPD反應體系參見應益昕等[18]。PCR反應體系為25 μL，包括17.9 μL超純水（ddH2O），2.5 μL 10×PCR緩衝液（100 mmol/L Tris，500 mmol/L KCl，20 mmol/L Mg2+，pH8.3），1.5 μL RAPD引物（10 μmol/L）；1.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.6 μL Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL模板DNA（約15 ng）。本文利用從200條RAPD引物中篩選出擴增條帶清晰、多態性豐富的24條RAPD引物對樣品中的土壤微生物種群進行了遺傳多樣性分析。　　PCR反應在BIOMETRA TGRADIENT 96型擴增儀上完成。擴增程序為：94℃ 1 min；94℃ 1 min，37℃ 1 min，72℃ 1.5 min，40個循環；最後，72℃延伸7 min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳及EB染色處理後，在BIO-RAD紫外凝膠成像儀上觀察、拍照。　　2.3數據採集及分析　　根據RAPD擴增產物的電泳結果，在遷移位置相同的瓊脂糖凝膠上無DNA條帶記為0，有DNA條帶記為1。用POPGENE Version 1.31軟體計算多態位點百分率、觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Neis基因多樣性指數（He）、Shannon信息指數（I）。用NTSYSpc Version 2.10e軟體中的非加權平均數（Unweight Pair-Group Method using arithmetic Averages，UPGMA）方法對統計數據進行聚類分析。　　　　3 結果與分析　　　　3.1土壤微生物RAPD擴增評價　　以試劑盒純化的土壤微生物基因組DNA為模板，經PCR擴增，共擴增出359條清晰、可辨的RAPD擴增條帶，其中多態性條帶324條，多態性率高達90.25%，擴增片段的長度介於200～900 bp之間。每條RAPD引物擴增的DNA條帶數介於7～24之間，平均每條引物可擴增出13.5條多態性條帶。其中，RAPD引物OPJ01擴增出的多態性條帶最多（23條），RAPD引物OPR8擴增出的多態性條帶最少（7條）。為RAPD引物OPR11在18份土壤微生物樣品中的擴增圖譜。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，篩選出的24條RAPD引物可在土壤樣品間擴增出豐富的多態性條帶，能夠用於供試土壤的微生物種群遺傳多樣性分析。　　3.2微生物種群遺傳多樣性分析　　有效等位基因數目（Ne）和Neis基因多樣性指數（He）是遺傳多樣性研究中最常用的衡量指標，具有重要的遺傳學意義。Shannon信息指數本身沒有遺傳學意義，但方便與同類研究進行比較。利用POPGEN Version 1.32軟體對土壤微生物種群遺傳多樣性分析結果表明，18份土壤樣品的平均觀察等位基因數為1.9753，平均有效等位基因數為1.4463，平均Neis基因多樣性指數為0.2776，平均Shannon信息指數為0.4335。就不同土壤樣品而言，其土壤微生物種群的遺傳多樣性存在較大差異，有效等位基因數最大值為1.6502，最小值僅為1.2738；Neis基因多樣性指數最大值為0.3666，最小值為0.1980；Shannon信息指數最大值為0.5392，最小值為0.3389，表明不同土壤樣品的微生物種群間存在較豐富的遺傳變異。　　3.3基於微生物種群遺傳多樣性的聚類分析　　根據18份土壤樣品的微生物種群和359個RAPD擴增位點的原始統計數據矩陣，經NTSYSpc Version 2.10e軟體分析，共獲得153個兩兩比較的遺傳相似係數，最大值為0.8457，最小值為0.5278。以0.65為閾值可以將18份土壤樣品劃分為6組，組I包括8份土壤樣品。其中土壤樣品1和樣品2、樣品3和樣品4為直播1年生人蔘，4份土壤樣品中的微生物種群遺傳相似係數最高；樣品7和樣品8對應4（3+1）年生人蔘，由於經過人工移栽，在新土壤環境中實際僅生長了1年，他們與土壤樣品1～樣品4的遺傳相似係數也較高。另外，該組還包括與土壤樣品15和樣品16對應的直播2年生西洋參。組II包括4份土壤樣品，分別對應5（2+3）年生人蔘根際土、6（3+3）年生人蔘根際土、4（1+3）年生西洋參根際土和6（3+3）年生人蔘根圍土。儘管4份土壤樣品對應不同的人蔘種，生長年限也不相同，但仔細研究發現，他們均在新移栽土壤中生長了3年，其微生物種群結構也最接近。組III包括2份土壤樣品，分別對應直播3年生西洋參根際土和直播3年生西洋參根圍土。組IV僅有4（1+3）年生人蔘根圍土1種。組V包括2份土壤樣品，分別對應直播3年生人蔘根際土和直播3年生人蔘根圍土。組VI也僅有5（2+3）年生人蔘根圍土1種。從上述聚類結果不難發現，栽培年限對土壤中的微生物種群結構的影響最顯著；其次，植物的種類對土壤微生物種群也有影響。儘管人蔘和西洋參同為五加科人蔘屬植物，但從分類學的角度講，他們屬於不同的種，組III和組V中土壤微生物種群的遺傳差異說明，即使是近緣植物，土壤微生物種群結構也可能存在差異。另外，根據相同參齡的人蔘（或西洋參）根際土和根圍土聚類分析結果，寄主植物對土壤微生物種群結構的影響表現有根際效應。　　　　4 討論　　　　目前，用於研究土壤微生物種群遺傳多樣性的分子生態學研究方法較多，如DGGE/TGGE、SSCP、T-RFLP、ARDRA等[19]。但是從研究技術自身特點而言，AFLP和RAPD的擴增條帶最為豐富、引物的結合位點隨機、能夠對土壤微生物全基因組進行掃描，最適合開展土壤微生物種群研究。AFLP擴增結果穩定，可重複性高，結合高分辨力的聚丙烯醯胺凝膠電泳，能夠對擴增產物進行高效分離，是研究土壤微生物種群遺傳遺傳多樣性的首選。但該方法建立在限制性酶切的基礎上，土壤微生物DNA提取物中的腐殖酸嚴重限制了該項技術在土壤微生態學研究中的應用[20]；另外，AFLP酶切時需要DNA模板的量較多（≥100 ng），如果微生物DNA提取量不夠大，土壤中的非優勢微生物種群將很難被發現[21]。儘管RAPD的擴增條帶數量和可重複性均不如AFLP，但該方法對微生物DNA模板的質量和數量要求較低，在熟練掌握PCR擴增技術，嚴格控制反應條件和擴增體系的基礎上，試驗結果的穩定性能夠得到保證[22]。　　土壤微生物是土壤的重要組成部分，土壤微生物種群結構多樣性與土壤養分循環、土壤微生態平衡、土壤理化性狀保持等密切相關[23]。本研究嘗試從土壤微生物種群遺傳多樣性變化的角度研究人蔘栽培過程中人蔘栽培土壤中微生物種群結構改變與土壤微生態環境惡化的關係。研究結果表明，不同栽培年限人蔘或西洋參根際土及根圍土中的微生物種群結構均在顯著差異，而且不同土壤樣品中的微生物種群結構在一定程度上表現有根際效應。結合前期我們開展的人蔘根系分泌物對人蔘致病菌的化感效應研究，我們推測：人蔘或西洋參根系分泌物對其根際及根圍土中的寄居的微生物形成定向選擇壓力，使得土壤微生物種群向著能夠以人蔘或西洋參根系分泌物為碳（氮）源的方向發展，長期的定向選擇壓力使得人蔘或西洋參栽培地中的土壤微生物無法行使正常的土壤代謝功能，進而影響了重茬人蔘或西洋參的健康生長。為論證上述推測的合理性，筆者目前正在開展人蔘栽培過程中土壤微生物種群結構及生態功能變化的TGGE和BIOLOG分析，以求對上述推測提供佐證。