Nature：揭示CRISPR

4月21日，哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授團隊在《自然》（《Nature》）在線發表了題目為《CRISPR-Cpf1結合crRNA的複合物晶體結構》（《The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA》）的研究論文。該項研究通過結構生物學和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1識別CRISPR RNA （crRNA）以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子機制，這對認識細菌如何通過CRISPR系統抵抗病毒入侵的分子機理具有十分重要的科學意義，而且為成功改造Cpf1系統，使之成為特異的、高效的全新基因編輯系統提供了結構基礎，讓人們可以更加高效地對目的基因進行「關閉」、「恢復」和「切換」等精準「手術」，使戰勝癌症和艾滋病等疾病成為可能。CRISPR-Cas系統是細菌編碼的適應性免疫系統，該系統通過RNA引導的效應蛋白剪切病毒的DNA或者RNA從而抵抗病毒的感染。該系統之一的CRISPR-Cas9系統被用來作為可編程的基因編輯工具用於細胞內目的DNA的剪切、激活表達、修飾、突變等。由於CRISPR-Cas9系統能夠在活細胞中高效地、便捷地「編輯」任何基因，作為科研、醫療等領域的強有力工具，已被廣泛地應用於全世界的生物和醫學實驗室。剛剛發現的CRISPR-Cpf1系統是一類新型的CRISPR-Cas系統，能夠在crRNA引導下在人類細胞內剪切目的DNA底物。而且，Cpf1本身也是一個具有序列特異性的RNase,這也是目前發現的唯一一個具有核酸序列特異性且同時具有DNase和RNase活性的核酸酶。Cpf1和Cas9很大的不同還在於：Cpf1僅需要一個拷貝的crRNA，而Cas9需要序列更長的tracrRNA和crRNA去識別、剪切底物DNA，較短的crRNA在轉染細胞過程中將更高效；Cpf1和Cas9識別DNA底物上的模塊（PAM）也不同；Cpf1剪切底物是通過粘性末端剪切，而Cas9是末端剪切，粘性末端剪切將更有利於基因編輯後的修復。在該項研究中，黃志偉團隊首先解析了結合了crRNA的Cpf1複合物的晶體結構。非常意外的是，Cpf1並不是之前人們推測的二聚體狀態，而是一個呈三角形的單體，位於該結構中間是一個帶有正電荷的凹槽。crRNA通過發卡結構形成高度扭曲的構象緊密結合在Cpf1的核酸結合結構域，和底物DNA配對的crRNA 3"末端位於Cpf1凹槽的一端。和Cas9結合的sgRNA顯著不同的是，Cpf1結合的crRNA的引導序列部分（guide sequence）並沒有電子密度，這說明在沒有底物結合的狀態下這部分序列和Cpf1的結合比較鬆散。據黃志偉介紹，結構觀察發現一個緊密結合crRNA的六水合鎂離子對穩定crRNA構象激活Cpf1的催化活性非常關鍵。當然，我們也不能排除鎂離子也同時直接參与了對底物的催化反應。通過比較Cpf1和Cas9複合物的結構發現，LHD區域推測可能是雙鏈DNA底物結合的PAM區域。該研究發現Cpf1在沒有crRNA結合的狀態下處於鬆散的構象，crRNA的結合引起Cpf1發生顯著的構象變化。與Cas9結合sgRNA極為不同的是，僅僅crRNA的重複序列部分（repeat sequence）就能引起Cpf1構象的巨大變化，這反映了這類短小的crRNA與Cas9結合的長sgRNA的識別機制的巨大差別。該結構顯示來自於H843、 K852以及K869催化殘基側鏈上的氮原子位於一個平面上，同時和RNA A(+20)的磷酸基團形成氫鍵，該結構證據表明Cpf1剪切pre-crRNA成為crRNA是一個鹼催化的反應。黃志偉為本研究論文的通訊作者，該團隊的碩士研究生董德、大四本科生任寬和博士生邱小林3位同學為該論文的並列第一作者。清華大學生命科學學院高寧教授實驗室、王佳偉教授、范仕龍博士參與該研究的部分工作。上海同步輻射中心為晶體數據收集提供了及時有效的支持。本項目受到國家自然科學基金委、哈工大青年科學家工作室等基金的資助。值得一提的是，這是我校本科生第一次在該頂級期刊參與發表研究論文，該文章也是黃志偉團隊在我校成立實驗室以來在病原與宿主相互作用領域發表在《自然》雜誌上又一項研究成果。（Nature, doi: 10.1038/nature17944）（生物谷 Bioon.com）
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