新型生物標誌物在炎症性腸病診斷中的新興作用

核心提示：炎症性腸病（IBD）沒有金標準試驗。醫師必須同時考慮臨床、內窺鏡和影像學以及血清學和組織學證據來正確診斷患者。內窺鏡評價不僅昂貴，而且對患者造成不適，穿孔風險大。使用生物標誌物幫助診斷和細分IBD是一個不斷擴展的領域。本文在聚焦那些更新型的試驗之前，談及了目前臨床使用的無創標誌物，有可能對診斷和區分IBD非常有用。

引 言

歐洲炎症性腸病（IBD）診斷和管理循證共識指出診斷應該通過醫師考慮很多因素包括臨床和內窺鏡評價以及組織學、血清學和影像學評估來完成。沒有金標準診斷工具。

腹痛伴隨或不伴隨排便變化是一級護理的常見主要癥狀。大多數IBD患者飽受功能性腸病，包括功能性消化不良和腸道易激綜合征。確實，功能性腸病佔據胃腸科門診患者的很大一部分（高達60%）。

醫師面臨的兩難局面是如何區分功能性疾病患者與潛在的IBD患者。高達50%的功能性疾病患者被推薦進行不必要的內窺鏡評價。

相反，真正的克羅恩病（CD）和潰瘍性結腸炎（UC）案例常常出現延診（也就是從癥狀出現到確診的延時）。這種延診在迴腸CD案例中更為顯著。

即使確診了IBD，如何細分為CD或UC仍存在不確定度。進一步細分很重要，因為這兩種情況的最佳治療和管理方式是不同的。CD與UC的鑒別診斷困難，大約10%患者被標註為不確定性結腸炎（IC）。

因此，很明顯，即使目前有很多可用的診斷工具，作為醫師我們仍在努力做出準確診斷。

任何研究性試驗在患者成本和舒適度上必須是可以接受的。內窺鏡評價通常不僅對患者造成不適、昂貴，而且，風險比較大比如穿孔。近期法國一項研究發現每10000名患者的穿孔率在4.5-9.7之間。影像學檢查，也許在小腸病理學研究中用處最大，但是在觀察員間和觀察員內變異方面具有缺點，而且很明顯不允許組織學取樣。

使用生物標誌物幫助診斷IBD是一個不斷擴展的研究領域。生物標誌物是「一種特徵，這種特徵作為正常生物過程、致病過程或對干預措施的藥理反應的指標，可以客觀測量和評估」。例如：膽固醇水平。然而，還沒有一個生物標誌物的靈敏度或特異性足以單獨用於確診IBD。很多生物標誌物只表明全身炎症，因此在用途上具有局限性。本文在聚焦新型生物標誌物開發的最新進展之前，談及了對IBD診斷和監測用途比較明確的那些生物標誌物。

本文將關注在IBD診斷和監測方面新型生物標誌物開發的最新進展。文獻中報道了大量生物標誌物。我們選擇考慮無創穫取的生物標誌物，因為它們對患者來說更易接受，從而在臨床應用上也最有前景。

對IBD診斷中新型生物標誌物的英文文獻的綜述基於文獻服務檢測系統（PubMed）資料庫包含的文章。利用邏輯運算元AND對PubMed資料庫進行個別搜索，包括術語：「生物標誌物」，「炎症性腸病」，「克羅恩病」和「潰瘍性結腸炎」。

通過摘要來篩查文章是否符合研究條件，所有相關文章都請求獲取全文。然後核對被請求文章使用的參考文獻，確定是否具有進一步研究的價值。

廣泛使用的生物標誌物

C-反應蛋白：在炎症作用下，肝細胞經過某些細胞因子刺激產生C-反應蛋白（CRP）。如果是活動期IBD，這些細胞因子包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-6和IL-1β。

在活動期IBD病例中CRP可能顯著升高。但是，這種升高不是特異性的，而且在很多情況下均可產生，包括感染、自身免疫疾病、其他炎症疾病、惡性腫瘤以及細胞壞死。

CRP升高情況可能因人而異，取決於個體的免疫應答；但是，研究表明CRP升高在CD中比UC中更常見。究其原因尚不明確，但是可能與CD病例中更深入、更穿透性的炎症有關，而在UC病例中觀察到的是表面粘膜炎症。研究還表明疾病部位可能影響CRP升高程度，與疾病嚴重程度無關。

在已知IBD患者中，已證明CRP升高與結腸鏡檢查活動性疾病和組織學重度炎症相關，因而有助於區分活動期IBD與靜止期IBD。

紅細胞沉降率：像CRP一樣，紅細胞沉降率（ESR）是衡量全身炎症的，不完全是IBD特有的。

該試驗衡量紅細胞在1小時內垂直下降的距離。ESR水平比CRP更晚達到峰值，下降速度更慢。鑒於此，ESR更適合監測疾病發作24小時後疾病活動度/治療反應，而CRP可能在24小時內更有用。

雖然ESR的用處相當有限，但是其很常用於監測IBD。ESR受到很多因素影響包括年齡、性別、貧血、血質不調和懷孕。

Yoon等人發現CRP和ESR只與內窺鏡活動適度相關，而且檢測內窺鏡活動緩解的靈敏度低表明單獨使用CRP或ESR不足以準確反映內窺鏡嚴重程度。

另外，最新meta分析顯示ESR水平不能預測IBD。IBD的最高預測概率是在ESR水平為200mm/h時，1.6%。

抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCAs）：針對中性粒細胞細胞質顆粒的抗體。這些抗體可以用間接免疫熒光法（IIF）檢測並表現出三種主要的染色模式：均質型（cANCA），斑點型（sANCA），和周邊型（pANCA）。已證明周邊型ANCA（pANCA）在UC中顯著升高。

Joossens等人發現在其前瞻性隨訪研究中，64%的UC患者為pANCA陽性[抗釀酒酵母抗體（ASCA）陰性]。進一步研究計算出pANCA在UC中的概率為55%，在健康對照者中的概率為32%。

在UC中，非典型pANCAs的出現與左側疾病治療抗性和早期手術有關。這表明pANCA的存在對鑒別需要免疫調節劑早期干預的UC患者有用。

ASCA：釀酒酵母（S. cerevisiae）細胞壁中甘露聚糖的抗體。

相比較而言，pANCA在UC中滴度較高，而高ASCA水平對CD的特異性更高。包含60項研究的meta分析研究了7860名IBD患者和3748名對照，證明了ASCA /pANCA-組合試驗對成年CD患者與UC患者的鑒別力，靈敏度55%、特異性93%。ASCA/pANCA水平還與迴腸疾病對應表型，疾病發作時年紀輕，狹窄，以及穿透行為和多次腸道手術有關。

ASCA/pANCA檢測雖然特異性水平高，但是靈敏度低，限制其在區分CD和UC方面的常規臨床使用。

糞鈣衛蛋白：鈣衛蛋白是鋅、鈣結合蛋白，屬於S100家族，主要來源於中性粒細胞和單核細胞，也能在活化巨噬細胞內檢測到。

鈣衛蛋白存在於血清、唾液、腦脊液、尿液和糞便中。它是一種極其穩定的蛋白，在糞便樣品中不作處理7天以上仍然不會改變。

炎性過程發生時，鈣衛蛋白由於中性粒細胞脫粒作用釋放出來，因此對胃腸道炎症的特異性非常高。

文獻中很多研究均關注糞鈣衛蛋白（FCP）用於診斷和監測IBD的準確度。糞鈣衛蛋白首先於1980年被描述，至今已成為廣泛使用的試驗。一項meta分析計算出FCP的靈敏度和特異性分別為95%和91%。另外，結果還表明FCP優於其他血清學標誌物包括CRP和ESR。

國家衛生保健優化研究所（NICE）建議使用FCP作為診斷工具幫助鑒別診斷IBD和腸道易激綜合征（IBS）。在一級和二級護理中使用時，FCP可有助於減少不必要進行內窺鏡評價的轉診數量。包含13項研究的meta分析認為FCP檢測將使需要內窺鏡檢查的成人數量下降67%，但是由於假陰性結果使8%的成人診斷延遲。關於FCP檢測的備受爭議之處在於適當臨界值的確定，結果高於臨界值被視為陽性。大多數中心將相對低水平50μg/g作為臨界值。

Pavlidis等人在一級護理中接受了糞鈣衛蛋白檢測的成年患者群體中研究了這個問題。在臨界值為50μg/g時，FCP檢測的陰性預測值（NPV）為98%，陽性預測值（PPV）為28%。將臨界值增加到150μg/g得出可比較的NPV 97%，和更高的PPV 71%。

結合這些數值，計算出通過將臨界值增加到150μg/g，結腸鏡檢查和可屈性乙狀結腸鏡檢查申請下降10%，代價是漏診4例IBD（n=686）。

糞乳鐵蛋白：乳鐵蛋白是一種鐵結合蛋白，覆蓋大多數黏膜表面。它存在於中性粒細胞內，在急性炎症情況下被激活。與糞鈣衛蛋白相似，乳鐵蛋白在糞便中可最多保持穩定5天。隨著中性粒細胞滲入胃腸道，糞乳鐵蛋白水平顯著增加。結果發現糞乳鐵蛋白水平在活動期IBD中比在非活動期IBD、IBS和傳染性腸病中顯著升高。一項研究報告糞乳鐵蛋白對UC的靈敏度和特異性分別是92%和88%，對CD的靈敏度和特異性分別是92%和80%。

Sidhu等人研究了在接受膠囊內窺鏡檢查的患者中小腸克羅恩病糞乳鐵蛋白水平之間的關係。他們發現糞乳鐵蛋白在經過膠囊內窺鏡檢查診斷為小腸CD方面的陽性預測值和陰性預測值分別為100%和83%。

像糞鈣衛蛋白一樣，糞乳鐵蛋白在測量IBD活動度上是一種靈敏度高和特異性強的標誌物。它有助於區分炎症性腸病和非IBD，並且能夠排除水平升高的IBS。

以前研究過的糞生物標誌物：應用於IBD診斷、嚴重程度評估和療效監測的其他糞便標誌物包括新喋呤和多形核中性粒細胞（PMN）-彈性蛋白酶。Nancey等人發現糞新喋呤與CRP相比，與內窺鏡活動的相關性更好。作者們還發現新喋呤在預測和監測IBD粘膜損壞嚴重程度上準確度堪比糞鈣衛蛋白。

已證明PMN-彈性蛋白酶能夠區分活動期IBD與非活動期IBD以及IBS，診斷準確度74.1%，高於CRP（64%）。

S100A12是鈣結合蛋白家族的一員（類似於FCP），是促炎介質的刺激物，在室溫下最多可穩定7天。

已證明S100A12的靈敏度和特異性水平分別高達86%和96%，優於FCP。結果還表明與其他生物標誌物相比，S100A12與腸道炎症的相關性更好，並且有可能用於療效監測。

然而，雖然S100A12很有價值，但是未應用於常規實踐，需要更多研究來證實其在IBD評估方面的用途。

新興的基於血液檢測的新型標誌物

抗外膜蛋白C：抗外膜蛋白C（anti-OmpC）是直接針對大腸桿菌外膜孔蛋白C轉運蛋白的抗體。據報道anti-OmpC見於55%的CD患者，而在UC患者和健康對照中數量不高。

研究表明anti-OmpC在輔助診斷ASCA陰性CD患者上具有一定價值。在ASCA陰性的患者中，anti-OmpC的流行率被報告為5%-15%。

鞭毛蛋白抗體：在鑒別結腸炎小鼠的共生細菌蛋白時發現顯性抗原是鞭毛蛋白。強烈的免疫應答見於一種特殊的鞭毛蛋白，anti-CBir1。50%的CD患者與CBir1具有IgG反應性，而在UC患者和健康對照中這個比例分別只有6%和8%。

在非典型的pANCA陽性CD患者中，40%-44%顯示為anti-CBir1陽性，與之相比非典型的pANCA陽性UC患者只有4%為anti-CBir1陽性。

因而，anti-CBir1檢測可有助於鑒別非典型的pANCA陽性CD和UC患者，與ASCA無關。

另外，研究發現anti-CBir1抗體在獨立於其他血清學標誌物之外與CD患者的迴腸受累有關，而且表明CD患者易受狹窄性和穿透性疾病影響。

近期，Schoepfer等人證明59%和57%的CD患者與兩種新的鞭毛蛋白抗體，anti-A4-Fla2和anti-Fla-X發生反應，與之相比只有6%的UC患者顯示與兩種抗體反應，這表明anti-A4-Fla2和anti-Fla-X可用於鑒別CD與UC。

Anti-I2抗體：從活動期CD的固有層單核細胞中識別出一個細菌DNA的片段（I2），研究表明該片段與熒光假單胞菌有關。

據報道Anti-I2陽性率在CD中為30%-50%，在UC中為2%-10%，在不確定性結腸炎中為36%-42%，在健康對照中為4%-8%。Anti-I2也發現於其他炎症性腸炎患者中（19%）。

抗糖抗體：研究發現CD患者表達不同致病細菌和真菌細胞壁糖表位的抗體。這些抗多糖抗體包括抗laminaribioside糖抗體（ALCA）（18%-38%），抗chitobioside糖抗體（ACCA）（21%-36%），和抗mannobioside糖抗體（AMCA）（28%）。CD患者發現ALCA, ACCA和AMCA的比例分別為18%-38%，21%-36%和28%。

Ferrante等人發現ALCA、ACCA和gASCA（類似於ASCA）中至少一項為陽性的CD患者可與UC患者區分開來，靈敏度77%，特異性>90%。然而，在區分CD患者與健康對照時，特異性下降到70.3%。

整體來說，很多研究發現這些抗多糖抗體的靈敏度較低，這也是限制其用途的一個原因。

胰腺抗體：研究發現外分泌胰腺的抗原特異性胰腺抗體（PABs）存在於20%-30%的CD患者中，但是只存在於2%-9%的UC患者中，在極少數非IBD相關疾病患者中也可以發現。

主要酶原糖蛋白2（MZGP2）近期被認定為PAB的初級自身抗原，促進了相關技術發展以便在臨床實踐中將其鑒別出來。

2014年，Pavlidis等人的研究通過新型ELISA技術，在迄今為止以這種方式被測的最大IBD群體中評估了PABs的臨床相關性。他們證實了抗MZGP2抗體對CD的高特異性和與疾病嚴重程度表型的關聯。IgA抗MZGP2抗體在早期疾病發作的CD患者中更為普遍（P=0.011）。另外，抗MZGP2陽性患者更常患有伴隨迴腸受累的廣泛性病變。病程越長的患者越有可能具有IgG抗MZGP2抗體。

α-1抗胰蛋白酶和粒細胞集落刺激因子：Soendergaard等人研究了疾病活動度不同的65名UC患者和40名健康對照的血清樣品。他們測量了α-1抗胰蛋白酶（AAT）和粒細胞集落刺激因子（G-CSF）的水平。

AAT水平能夠區分輕度、中度和重度UC，性能比CRP好。

另外，作者們發現在被診斷為UC的患者中測量AAT和G-CSF組合有足夠的統計功效以區分具有輕度、中度和重度疾病活動度的患者。

遺傳學

最近，很多全基因組關聯研究（GWAS）在調查UC和CD特異性基因組圖譜時發現許多易感位點。

Ellinghaus等人發現兩個基因變種PRDM1和NDP52決定了CD的易感性。PRDM1接近GWAS識別的一個CD區間，編碼一種由T細胞和B細胞表達的轉錄因子。NDP52編碼一種在胞內細菌自體吞噬過程和信號分子中發揮作用的蛋白質，支持自體吞噬在CD發病機理中所起的作用。

IBD晶元歐洲項目研究了大量CD-單核苷酸多態性以確定其對這種疾病臨床病程和表型的影響。研究發現NOD2基因是最重要的遺傳因子，是迴腸部位、狹窄性和穿透性CD的獨立預測因子。NOD2還與更複雜的病程和是否需要手術有關。

更新的CD和UC GWAS meta分析報道了從75000多個病例和對照獲得的重大發現。作者們識別了71個新關聯，使已證實的IBD易感位點總數增加到163。他們發現大多數位點與CD和UC表型都有關。有趣的是，IBD和分枝桿菌感染的易感位點之間存在相當大的重疊，表明宿主對分枝桿菌與患者對IBD的反應路徑相同。

從傳統上來說，CD與Th1細胞因子譜有關，而UC與Th2細胞因子譜有關。但是，這種概念自從Th17細胞和Treg細胞被發現後受到了挑戰。GWAS指出IL23R和參與Th17分化的另外五種基因（IL12B, JAK2, STAT3, CCR6和TNFSF15）都與CD易感性有關，在一定程度上也與UC有關。

至於遺傳學在IBD診斷中的臨床應用，有些焦點聚集在從內窺鏡活檢得到的結腸組織中識別出遺傳標記。von Stein等人識別了在IBD中差異表達的七種基因，使用臨床診斷作為金標準有可能區分UC、CD和IBS患者（P < 0.0001）。

最近，為了繼續這項研究，對病程更為複雜的78名患者（38很可能為UC、18名CD、22名IBDU）的活檢材料進行相同的基因組合檢測。測試結果導致很多初次診斷為UC和CD的患者的初步診斷髮生變化，並且表明大多數IBDU患者和急性結腸炎患者的診斷在臨床上是可能的。

表觀遺傳學描述的是影響基因表達但是不改變DNA序列的基因-環境交互作用。

微小RNAs（miRs）是單鏈的非編碼RNAs，長度大約為22個核苷酸，在整個演變過程中高度保守。由於它們在1990s年代已被描述，至今已發現超過1600個人類miRs。miRs被RNA聚合酶轉錄成pre-miR，然後分別在細胞核和細胞質內加工。miRs調節基因表達和很多生物過程比如細胞增殖、分化和死亡。miR表達變化與許多疾病包括IBD有關。

很多研究著眼於IBD患者vs對照以及CD患者 vs UC患者外周血樣品中的miRs圖譜。結果發現若干miRs上調或下調了。一項兒科研究還發現與健康對照相比，兒童血清樣品之間的某些miRs水平差異表達。

近期Schaefer等人的一篇文章發現CD與全血中6個miRs的表達變化有關，而UC與全血中9個miRs的表達有關。他們還發現UC和CD患者唾液中不同miRNAs的表達變化。

他們認為特異性miRNA表達模式與UC vs CD有關，因此檢查唾液和血液樣品中的miRNA表達有利於監測或診斷IBD患者。

代謝組學是指生物樣品中很多小分子代謝物的研究，以便測定特定細胞過程的潛在指紋圖譜。

目前用於代謝組學的主流技術包括1H NMR光譜法，氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）和液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）。這些技術具有極其靈敏、成本效益好、高通量的優勢。

1H NMR光譜法是至今最廣泛應用於IBD患者不同生物流體研究的方法。很多研究報告了IBD患者和健康對照以及CD和UC之間代謝圖譜的差異。

以上描述的這些研究主要集中於氨基酸檢測，TCA循環中間產物，脂肪酸代謝物和嘌呤代謝。

腸道細菌的代謝物在尿液中檢測到。任何腸道菌群變化（已證明在IBD發病機理中發揮重要作用），都可能影響尿液代謝圖譜。因而，將尿液代謝物作為IBD的潛在生物標誌物是一個很有吸引力的選擇。

Williams等人的研究利用1H NMR光譜法調查了CD和UC患者的尿液代謝圖譜。他們發現IBD患者的馬尿酸鹽水平（來源於微生物區系的一種代謝物）顯著下降。

其他研究利用1H NMR光譜法也證明IBD患者存在低水平馬尿酸鹽，另外，馬尿酸鹽可以區分IBD患者和健康對照。

大量研究表明利用1H NMR光譜法分析血清和血漿的代謝圖譜能夠區分UC和CD，但是可靠性低於鑒別UC/CD患者與健康對照的可靠性。

進一步研究發現氨基酸和TCA循環相關代謝物的圖譜能可靠區分UC和CD，而且氨基酸的代謝圖譜與疾病活動度有關，表明在監測IBD方面具有作用。

與健康對照相比，IBD患者糞提取物的代謝圖譜表明短鏈脂肪酸的水平顯著下降。

腸道菌群以及糞提取物代謝物的圖譜也可能進一步指示IBD患者的腸道細菌失調，從而確定疾病的發病機理。

代謝組學和IBD領域的另一進展是將呼吸試驗作為潛在的生物指標。

近期Kurada等人的綜述發現文獻中只有12篇小研究評估了呼吸代謝組對IBD診斷的價值。在診斷和鑒別IBD時，這些研究測量的揮發性有機化合物（VOCs）主要包括戊烷、乙烷、丙烷、丁烷和一氧化氮（NO）。

Kurada等人證明與健康對照相比，IBD患者（CD>UC）的戊烷水平升高，Pelli等人的發現也是如此。此外，Pelli等人還表明乙烷和丙烷水平都與IBD有關（兩者P值均≤ 0.001）。研究表明UC患者呼出的NO比CD患者高。

至於疾病活動度，一項研究發現呼吸戊烷水平與WBC掃描攝取直接相關。結果發現乙烷水平也與疾病的內窺鏡活動相關。

雖然研究發現一些很有價值的結果，但是呼吸分析還沒有準備好用於臨床。需要進一步研究來確定IBD的準確呼吸代謝組模式。

蛋白質組學在鑒別新的生物標誌物方面是更新的發展領域。它基於健康和病態組織的蛋白質表達分析並執行蛋白質譜分析。

Meuwis等人研究了120名患者（30名CD，30名UC，30名炎性對照和30名健康對照）的血清。他們識別了急性期炎症的4種蛋白（PF4、MRP8、FIBA和Hpα2）。

最新研究調查了白介素-10敲除[IL-10（-/-）]小鼠的循環蛋白生物標誌物，該模型建立了一種在結腸中佔據主要地位、依賴時間的類IBD疾病。他們識別了與早期無炎症IL-10（-/-）小鼠相比，在中晚期IL-10（-/-）小鼠血清樣品中不同程度累積的共15種不同的蛋白，表明蛋白質譜在評估疾病嚴重程度和療效上具有作用。

結 論

IBD診斷和鑒別需要更準確和成本效益好的生物標誌物。為了容易被患者接受和避免具有危險的侵入性評估比如內窺鏡，無創生物標誌物的發展很重要。

當前的血清檢測包括CRP和ESR，便宜、可靠但是特異性不高，因此不夠理想。基於糞便的檢測比如糞鈣衛蛋白是特異性更高的工具，很多有利證據支持其用於臨床。

應該注意的是，至今為止，雖然近期取得了進步，但是在測試結果為陽性的情況下，不做驗證性的結腸鏡檢查，沒有可靠的生物標誌物可以確診IBD。而是，這些無創試驗目前被用作內窺鏡評價的輔助工具和避免不必要的程序，陰性結果表示不存在潛在炎症和病理狀態。

無創取樣的臨床價值最高，並且隨著代謝組學、遺傳學和蛋白質組學的最新進展，現在更多工具可用於開發靈敏度高和特異性強的生物標誌物來診斷和區分IBD。

本文談及了在不斷擴展的IBD生物標誌物領域取得的重大進步。但是，需要更多工作來將這些新技術應用到日常臨床實踐中。

（摘自World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics，版權歸其所有，僅供內部學習）

編譯：王小茜