飼用微生物酶的生產和應用

一、微生物酶的分類、作用機理及來源 　　1.1澱粉酶。澱粉酶是能夠分解澱粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-澱粉酶、β-澱粉酶、糖化酶和異澱粉酶。　　α-澱粉酶又稱澱粉1，4-糊精酶，能夠切開澱粉鏈內部的α-1，4-糖苷鍵，將澱粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑麴黴、米麴黴和根霉。　　β-澱粉酶又稱澱粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從澱粉分子非還原性末端切開1，4-糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用於澱粉的產物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由麴黴、根霉和內孢霉產生。　　糖化酶又稱澱粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用於澱粉分子的非還原性末端，以葡萄糖為單位，依次作用於澱粉分子中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖。此酶作用於支鏈澱粉後的產物有葡萄糖和帶有α-1，6-糖苷鍵的寡糖；作用於直鏈澱粉後的產物幾乎全部是葡萄糖。此酶產生菌主要是黑麴黴(左美麴黴、泡盛麴黴)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、擬內孢霉、紅麴黴。　　異澱粉酶又稱澱粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用於枝鏈澱粉分子分枝點處的α-1，6-糖苷鍵，將枝鏈澱粉的整個側鏈切下變成直鏈澱粉。此酶產生菌主要是嫌氣桿菌、芽孢桿菌及某些假單孢桿菌等細菌。　　1.2蛋白酶。蛋白酶系催化分解蛋白質肽鍵的一群酶的總稱，它作用於蛋白質，將其分解為蛋白腖、多肽及遊離氨基酸。此酶種類繁多，廣泛存在於所有生物體內，按其來源可分為植物蛋白酶、動物蛋白酶、微生物蛋白酶(又可分為細菌蛋白酶、放線菌蛋白酶、黴菌蛋白酶等)；按其作用形式可分為肽鏈內切酶、肽鏈外切酶；按所產蛋白酶性能分為酸性蛋白酶、黴菌蛋白酶酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶。　　酸性蛋白酶(最適pH=2～5)產生菌主要是黑麴黴、米麴黴、根霉、微小毛霉、似青黴、青黴、血紅色螺孔菌等的某些種；中性蛋白酶(最適pH=7～8)產生菌主要是枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、米麴黴、棲土麴黴、灰色鏈黴菌、微白色鏈黴菌、耐熱性解蛋白質桿菌等；鹼性蛋白酶(最適pH=9～11)主要產生菌為枯草桿菌、臘狀芽孢桿菌、米麴黴、棲土麴黴、灰色鏈黴菌、鐮刀菌等。　　微生物產生的蛋白酶大多是幾種酶的混合物，只不過是主次之分而已。另外，改變培養基的組成或者菌種經誘變，可以改變產酶的性能，例如，據報道，黑麴黴的變株可生產鹼性蛋白酶，米麴黴的變株可生產酸性蛋白酶。　　1.3纖維素酶。纖維素酶是降解纖維素β-1，4-葡萄糖苷鍵的一類酶的總稱，因此纖維素酶又有纖維素酶複合物之稱。通常認為主要包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶。C1酶主要作用天然纖維素，將其轉變成水合非結晶纖維素；CX酶又可分為CX1酶和CX2酶，CX1酶是內斷型纖維素酶，它從水合非結晶纖維素分子內部作用於β-1，4-糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二糖，CX2酶為外斷型纖維素酶，它從水合非結晶纖維素分子的非還原性末端作用於β-葡萄糖苷酶又稱纖維二糖酶，它作用於纖維二糖，生成葡萄糖。這些酶協同作用可將纖維素徹底降解為還原糖-葡萄糖。纖維素酶可破解富含纖維的細胞壁，使其包含的蛋白質、澱粉等營養物質釋放出來並加以利用，同時又可將纖維降解為可被畜禽機體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率。產生纖維素酶的微生物研究較多的是真菌，對細菌和放線菌研究很少。當前用來生產纖維素酶的微生物主要是木菌、黑麴黴、青黴和根霉，此外，漆斑霉、反芻動物瘤胃菌、嗜纖維菌、產黃纖維單孢菌、側孢菌、粘細菌、梭狀芽孢桿菌等也能產生纖維素酶。 由於纖維素酶難以提純，實際應用的纖維素酶(尤其在飼料工業中)一般還含有半纖維素酶和其他相關的酶如果膠酶、澱粉酶、蛋白酶等。　　1.4半纖維素酶。半纖維素酶是分解半纖維素(包括各種降戊糖與聚己糖)的一類酶的總稱，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。這些酶的主要作用就是降解畜禽消化道內的非澱粉多糖，降低腸道內容物的粘性，促進營養物質的消化吸收，減少畜禽下痢，從而促進畜禽生長和提高飼料利用率。半纖維素酶主要由各種麴黴、根霉、木霉發酵產生。在飼料工業中應用較多的是β-葡聚糖酶，它主要由麴黴、木霉和桿菌屬類微生物產生，它應用於以大麥替工玉米的日糧中，藉以降低飼養成本，而達到與玉米相同的飼餵效果。　　1.5果膠酶。果膠酶是分解果膠的酶的通稱，也是一個多酶複合物，它通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶三種酶。這三種酶的聯合作用使果膠質得以完全分解。天然的果膠質在原果膠酶作用下，被轉化成水可溶性的果膠；果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基因，生成果膠酶；果膠酸酶切斷果膠酸中的α-1，4-糖苷鍵，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸進入糖代謝途徑被分解放出能量。工業生產果膠酶的菌種主要是黴菌，常用菌種有文氏麴黴、蘋果青黴、黑麴黴、白腐核菌、米麴黴、酵母等，此外，木質殼霉、芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、葡萄孢霉、鐮刀霉也能產生果膠酶。飼料工業中果膠酶多用於提高青貯飼料的品質。　　1.6脂肪酶。脂肪酶作用於脂肪中的酯鍵，將脂肪分解成脂肪酸和甘油。生產脂肪酶的微生物主要有假絲酵母、園酵母、黑麴黴、根霉、白腐核菌、白地霉、青黴、毛霉、鐮刀霉及假單孢菌、無色桿菌、葡萄球菌等。　　1.7植酸酶。植酸酶是降解飼料中植酸及其鹽的酶。飼料中玉米、大豆、豆餅及穀物中的磷，大部分存在於植酸和植酸鹽中，這種形式的磷不能或很少被單胃動物利用，同時，植酸和植酸鹽還是影響動物體內微量元素消化利用的螯合劑，嚴重影響二價陽離子礦物元素的利用，最終導致飼料成本增加、磷源浪費和環境污染。在飼料中添加植酸酶，可將植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸鹽，供動物吸收利用，從而提高磷的利用率和骨骼礦化程度，減少飼料中磷源的添加和糞便中磷的排出，減少環境污染。產生植酸酶的微生物主要是酵母菌、黴菌和細菌。　　二、微生物酶的生產　　2.1培養基。培養基不同，微生物的比生長速率和酶形成能力也不同，因而在培養基中提供適當而豐富的營養物，是菌體生長和酶大量產生的重要前提。酶製劑生產中所用原料主要包括碳源(包括能迅速利用的單糖、雙糖和緩慢利用的澱粉、纖維素等多糖)、氮源(包括豆餅粉、花生餅粕、魚粉、蠶蛹粉、酵母粉、玉米漿等有機氮源和銨鹽、硝酸鹽等無機氮源)、無機鹽和誘導物，固體發酵往往還要加入一定量利用通風的載體如稻殼、玉米皮等。實踐證明，培養基中碳源與氮源的比例即碳氮比(通常用C/N表示)就直接影響菌體的生長、繁殖和酶的生成。當C/N比值過小時，即培養基中氮源過多，造成微生物生長過盛，而碳源供應不足，容易引起菌體衰老和自溶，造成氮源浪費和酶產時下降；如果C/N比值過高，即氮源不足，微生物生長過慢，一方面容易引起雜菌感染，另一方面由於沒有足夠量的微生物來產酶，也會造成碳源糧費和酶產量下降。因此，應根據各種微生物的特性，恰當地選擇適宜的C/N比值，是提高酶產量的重要措施。各種無機鹽類和微量元素如磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、鋅、錳等，是微生物細胞結構的重要成分或酶的組成成分或維持酶的活性，能促進微生物生長、發育、刺激酶的生成，培養基中不可或缺。對於含複雜成分的培養基來說，原料和水中往往已含有足夠量的無機元素，一般不需另外添加。但不同菌種的需要量不同，應通過實驗來研究確定。飼料工業所用微生物酶大都屬於誘導酶類，因此向培養基中加入誘導物就會增加胞外酶的產量。如加入槐糖能誘導木黴菌的纖維素酶的生成，木糖誘導半纖維素酶的生成。但誘導物價格往往比較昂貴，實際生產中一般加入廉價的含有誘導物的原料來代替，如槐豆莢等某些植物的種籽皮中含有槐糖，玉米芯富含木取糖，培養過程中可陸續被水解產生槐糖、木糖。 2.2產酶微生物的要求。生產酶製劑所用菌種要能利用比較廉價和簡單和原料，且食性越廣越好，在不需添加誘導劑的條件下容易生長，且生長迅速；產生的酶容易分離純化和濃縮，酶活性要高，穩定性要好，活性譜要寬；產酶微生物應具有穩定的生理特性，而且不形成有毒或致免疫的代謝物。特別要說明的是，產酶菌種除公認是安全菌株外，都要做毒性實驗。　　2.3發酵生產。微生物酶的生產，目前主要採用液體深層發酵和固體發酵兩種方式。與其他培養方式相比，液體深層發酵具有如下優點：1)液體懸浮狀態是許多微生物的最適生長環境；2)在液態環境中，菌體、底物、產物(包括熱)易於擴散，使發酵在均質或擬均質條件下進行，便於檢測、控制，易擴大生產規模；3)液體輸送方便，易於機械化操作；4)產品易於提取精製。與液體發酵相比，固體發酵具有如下缺點：1)生產工藝主要限於耐低水活性的菌中；2)微生物生長速度較慢，產物有限；3)大規模操作時，產生的代謝熱較難散去，生產過程中固態發酵參數難以準確測定，難以實現操作的機械化及控制的自動化；4)生化反應器的設計還不完善，傳統的發酵方式易染雜菌。但是，固體發酵也具有很多液體發酵所不具備的優點，主要表現為：1)培養基簡單，多為便宜的天然基質；2)基質的低含水量可大大減少生化反應器的體積，不需要廢水處理，較少環境污染，常不需要嚴格的無菌操作，後處理加工方便；3)不一定連續通風，一般可由間歇通風或氣體擴散完成；4)產物的產率可較高；5)設備簡單，投資小，能耗低。由於飼料工業附加值低，飼料用酶無需精製，因此，採用固態發酵更為合適。國內複合酶製劑的生產一般採用固態發酵，液態發酵主要用於植酸酶的生產或生產單酶製劑用於復配合酶製劑。　　微生物酶的發酵生產是由微生物的生化活動和環境條件相互作用完成的。在發酵生產中，只有環境條件能夠被直接調節和控制。除培養基成分及其濃度外，接種量、溫度、pH、溶解氧等環境變數也都能影響微生物代謝活動，在固體發酵中，發酵空間的空氣濕度及物料含水量也嚴重影響菌種的代謝活動和產酶量。菌種不同，生產酶製劑所需工藝條件也不同，其最佳工藝參數必須通過實驗來確定。只有為培養物提供一個最適的環境，菌體的代謝活動才能得到最充分的表達，酶產量才高。　　2.4酶的提取。在發酵基質中，酶都與大量的其他物質共同存在，而且酶的含量比其他物質要少得多，因此工業用酶需從大量的其他物質中將酶分離出來。但飼料用酶無需純酶，且發酵所用基質及菌體在生長過程中所產生的氨基酸、維生素、核苷酸、促生長因子等成分對畜禽生長都是有利的，因此飼料用酶無需精製，只要將發酵基質進行濃縮(對液體發酵來講)、乾燥獲得粗酶製品即可。　　2.5酶的保藏。酶是生物活性物質，酸、鹼、有機溶劑、重金屬、表面活性劑、高溫、紫外線等一些理化因素易引起酶結構發生變化，造成酶的失活，保藏時應注意避免這些不利因素。對於酶的保藏，要保持酶長期不失活，關鍵要控制好水分和溫度兩個條件。一般含水量高時酶易失活，含水量超過10 %，在室溫或低溫下均易失活；含水量降至5 %時，在室溫或低溫下較穩定，溫度越高，越易失活。因此最好在低溫下保存酶製品，特別是酶製品含水分較高時，更宜低溫保存。日光照射有時也引起某些酶的失活，因此酶應避免日光直射。一些重金屬離子(如銅、鐵、鉛、汞、銀等)會抑制酶的活力，甚至會使酶失活，應盡量避免與這些物質接觸。酶的底物和某些物質具有保存酶的作用，因此酶貯存時應根據酶的不同特性添加酶的穩定劑或進行包被處理，以使酶長期保存不失活。　　三、微生物酶的應用　　3.1酶製劑在飼料工業中的應用日益廣泛，從最初就用於仔豬、肉雞逐步推廣到生長豬、蛋禽、珍禽及草食動物、水產養殖中，從東南沿海逐漸延伸到西北內地。最初人們只是使用單一酶製劑，由於單一酶製劑成分單一，而飼料原料成分複雜，各地飼料原料、飼養方法、飼養環境各異，因而使用效果不太理想。現在，除了植酸酶還可作用單項酶製劑應用外，人們普遍使用含有多種酶類的複合酶製劑。由於各酶類之間相互協相互促進，因而複合酶製劑的使用效果較好。複合酶製劑，有的是採用多種單一酶製劑復配而成，有的是有用多株菌種協同發酵而成。由於多株菌種協同發酵的酶製劑除含酶製劑成分較多外，菌種生長過程中還產生一些氨基酸、維生素、促生長因子、核苷酸等成分。因此使用效果比復配的酶製劑要好。　　3.2複合酶製劑的設計，應根據各種酶的特性、活性及飼料原料、飼養對象的不同而不同。有些酶製劑，體外測定活性挺高，作用效果也不錯，但應用效果並不理想。主要原因是體外測定試驗時其作用條件與畜禽消化道內的生理條件相差很大，致使高活性在畜禽體內表現不出來。如有些澱粉酶的最適作用溫度為60℃，在畜禽體內(40 ℃在右)活性就達不到這麼高；有些酶只有鹼性條件下才發揮作用，畜禽體內的酸性環境就可使該酶失活。因此，選擇酶製劑時，最好使酶的最適作用條件與畜禽消化道條件相一致，以使酶最大限度地發揮其作用。　　3.3複合酶製劑所含酶的種類也並非越多越好，應根據飼料原料及飼餵對象而設計。如β-葡聚糖酶，國外主要用於添加於大麥日糧中以降解β-葡聚糖，而我國飼料主要以玉米-豆粕型日糧為主，添加β-葡聚糖酶就沒有什麼效果；果膠酶主要用於降解果膠，飼料中如無青貯飼料，添加該酶也沒有明顯效果。不同的飼餵對象、甚至同一飼餵對象的不同生長階段，體內所需酶類也不一樣，因此添加的外源酶製劑也不應相同，以免造成酶製劑的浪費或添加量不足，影響飼養效益。　　四、現階段存在的問題　　4.1微生物酶的生產屬於微生物發酵的範疇，而應用屬於畜牧業的範疇，由於專業間的差異，給酶製劑的管理造成一定困難。至今國內尚無飼料用酶製劑統一標準，各生產單位為了使用方便各自利益，自己制訂活力單位、檢測標準，給酶製劑質量評定、飼餵應用帶來一定的困難，同時也不利於生產工藝的進一步優化和產品質量的提高。　　4.2飼料用酶製劑發酵國內大多採用固體發酵，由於固體發酵生產工藝存在的一些缺陷目前無法克服，造成產品質量不如液體發酵穩定，在生產中(尤其是一些小廠家)有時帶入雜菌，給應用帶來一定的不利因素。　　4.3飼料加工過程(主要是制粒)中的高溫、配合飼料中的重金屬離子、動物體內環境等可導致酶製劑失活，因此酶的穩定性是酶應用中的一大問題。應用中應注意對酶製劑進行穩定化處理。此外，篩選優良菌種或通過基因工程技術對菌種實行改造，使之產生的酶能耐高溫、有較寬的pH作用範圍等抗不良外界條件的性能，也是可供選擇的一種好方法。(蘇柯漢供稿)

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