腫瘤動物模型的構建——皮膚癌篇

07-01

導讀皮膚癌是由於皮膚細胞的過度增殖和突變而導致的一種惡性腫瘤，主要分為非黑色素瘤和黑色素瘤。近年來皮膚癌患者群體龐大，全球每年約500萬人被診斷為皮膚癌，在美國每5個人就有1個皮膚癌患者，且患病率逐年上升[1]。因此，建立準確的腫瘤動物模型，對於皮膚癌的機制研究和治療具有重大意義。

本期就先為大家綜述了皮膚癌中非黑色素瘤的基本知識及常用小鼠模型的建立和應用。

首先，我們看一組照片：美國皮膚癌的發病率

如下圖所示：美國每年皮膚癌患者為350萬，佔到全球70%，且每年的皮膚癌患者要比其他所有癌症加起來都要多，而且用於治療的費用也非常巨大（約23億美元/每年）[2]。可見美國皮膚癌的嚴峻形勢。

美國皮膚癌的發病率

第一章：皮膚癌基本常識

皮膚癌的分類

一般根據皮膚細胞變異類型主要分為：非黑色素瘤(Nonmelanoma skin cancer)和黑色素瘤（melanoma）。其中非黑色素瘤又包括基底細胞癌（Basal cell carcinoma）和鱗狀細胞癌（Squamous cell carcinoma），其中鱗狀細胞癌。惡性程度更高。如下圖所示：

皮膚的結構及皮膚癌的分類（From MAYO）

非黑色素瘤

皮膚癌中非黑色素瘤佔98%，黑色素瘤為2%。梅奧診所最新的研究，從2000至2010年間，鱗狀細胞癌診斷增加了263%，基底細胞癌增加了145%[3]。引起非黑色素瘤的主要原因是紫外線（UV），90%的皮膚癌都是由紫外線引起的[4]，同時還有如遺傳，HPV，免疫抑製藥物和電離輻射等因素[5]。

非黑色素瘤的發生過程

非黑色素瘤的發生是一個非常複雜多樣的過程，其發生機制尚未十分清楚。它的發生常伴隨著與細胞增殖、分化、基因組完整性、DNA修復、凋亡誘導等一系列相關基因的改變。主要包括三個階段：發生(initiation)、發展(promotion)、惡化(progression)，如下圖[6]。

第二章：實驗研究常用的非黑色素瘤模型

非黑色素瘤模型中皮膚鱗癌小鼠模型是更加常見實用的模型。接下來主要介紹2種皮膚鱗狀細胞癌的動物模型。

一、誘導型的皮膚癌模型

1. DMBA/TPA誘導小鼠皮膚鱗狀細胞癌模型

原理：即採用化學試劑誘導的小鼠皮膚鱗狀細胞癌模型，DMBA(7,12-dimethylbenz[a]anthracene)作為誘變致癌劑，TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)作為腫瘤促進劑，一般稱為化學誘導二步致癌法。

構建方法：取6-7周齡的健康雌性或雄性C57BL/6小鼠，用寵物剃毛刀剃去小鼠背部毛髮，盡量剃凈，大小相似。先塗抹DMBA，一周後開始塗抹TPA，每周塗抹兩次。10周左右，小鼠皮膚會出現很小的腫瘤，接下來腫瘤會逐漸增多增大，一般塗抹至25周左右。操作步驟如下圖。

DMBA/TPA兩步致癌法

優點：簡單易操作，時間周期短，成功率很高，是皮膚鱗癌建模最為經典和常見的方法。

數據分析：如下圖，在塗抹到DMBA/TPA至25周時，小鼠背部均出現腫瘤及其腫瘤切片，確定為皮膚鱗狀細胞癌SCC。

DMBA/TPA 誘導皮膚癌產生

2. UVB誘導小鼠皮膚鱗狀皮膚癌模型

原理：紫外線是誘導皮膚癌的主要因素，紫外線主要包括UVA，UVB和UVC。UVC絕大部分被大氣層所吸收，極少能到達地球表面。對皮膚具有損傷的主要是UVA和UVB。UVB主要對損傷表皮細胞，造成p53之類基因的突變，從而誘發皮膚癌，而UVA能夠到達真皮層，形成光老化[7]。

構建方法：6-7周齡大小的健康的雌性SKH-1或C57BL/6或BALB/c（模型建成容易度（SKH-1>Bablc>C57BL6）），用寵物剃毛刀剃除小鼠的毛髮，盡量剃乾淨。用適量的戊巴比妥鈉麻醉小鼠後，放入紫外儀平台上，初始劑量180mJ/m²，每周照射3次，每周增加10mJ/m²，直至劑量為300mj/m²，連續照射40周，如下圖。

UVB誘導皮膚癌方法

優點：因為人90%的皮膚癌是由紫外線照射而誘發的，所以UVB小鼠模型能更接近，更好的模擬人類皮膚癌的發生，更加有利於科學家們對皮膚癌發生機制的探索和研究。

缺點：但是耗時比較長，實驗周期久。

數據分析：如下圖，經過UVB長期的照射，小鼠背部均出現了大小各異的腫瘤及其腫瘤切片的情況。紅色箭頭代表誘導的皮膚腫瘤。

UVB 誘導小鼠皮膚癌產生

二、異種移植性模型

異種細胞移植性模型（CDX）是皮膚癌研究中常用的一種模型，即將腫瘤細胞注射到小鼠皮下，待數天後，在皮膚中能夠長出腫瘤。

常用細胞：人鱗狀細胞癌A431，常用免疫缺陷小鼠BALB/c Nude， SCID。

構建方法：

取指數生長期A431細胞，胰酶消化計數後，製成10⁶-10⁷/ml的細胞懸液。
取100ul細胞懸液，注射到小鼠後腿側面的皮下。
移植後，進行給葯，待腫瘤長出後，每周測量小鼠腫瘤的體積和小鼠的體重。

優點：模型易建立，成瘤率高，常用於藥物或基因對於皮膚癌生長，發展的影響。

上述就是本期為大家介紹的常見的非黑色素瘤模型，下一期我們將繼續介紹皮膚癌中的黑色素瘤模型。隨著臭氧層空洞逐漸擴大，照射到地球表面的紫外線也越來越強，皮膚癌，光老化的發病率日益上升。

因此，科學預防皮膚癌也十分重要，這裡溫馨提醒大家，生活中盡量避免紫外線長時間照射，外出時都應該給裸露在外的皮膚塗抹防晒霜哦！

參考文獻

1.Robbins, P.. Skin Cancer Facts and Stats. (2016, June 8).

2.Skin cancer. (n.d.). American Academy of Dermatology. Retrieved July 11, 2014.

3.John G.Muzic, Adam R.Schmitt, et al. Incidence and Trends of Basal Cell Carcinoma and Cutaneous Squamous cell Carcinoma. Mayo Clinic Proceedings (2017).

4.Gallagher, R. P., T. K. Lee, C. D. Bajdik, & M. Borugian, (2010). Ultraviolet radiation. Chronic Diseases in Canada, 29, 41.

5.De Vries E, Trakatelli M, Kalabalikis D, et al. Known and potential new risk factors for skin cancer in European populations: a multicentre case–control study[J]. British Journal of Dermatology, 2012, 167(2): 1-13.

6.Rundhaug J E, Fischer S M. Molecular Mechanisms of Mouse Skin Tumor Promotion[J]. Cancers, 2010, 2(2): 436-482.

7.Dorazio J A, Jarrett S G, Amaroortiz A, et al. UV Radiation and the Skin[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(6): 12222-12248.