(1)端粒與細胞壽命和抗癌[轉]

理論上說，細胞的壽命決定於端粒的長度和端粒ＤＮＡ在體內的消減速度。　　早在1938年，Muller便發現了端粒（Telomere），然而對端粒的深入研究卻開始於20世紀70年代後期。端粒酶（Telomerase）是1985年由Blackbun實驗室在四膜蟲細胞核提取物中首先發現並純化，隨後在尖毛蟲（Oxytricha）、游仆蟲（Euplotes）及人的Hela細胞等細胞中被證實。有關研究表明，端粒、端粒酶與細胞壽命直接相關，端粒酶的激活和表達程度與腫瘤的發生和轉移也有十分密切的關係。　　1　端粒　　端粒是存在於真核生物線性染色體末端，由串聯重複的短的ｄｓＤＮＡ序列及其相關的蛋白所組成的ＤＮＡ－蛋白複合體。ｄｓＤＮＡ中的一條為富Ｇ鏈，以5′→3′指向染色體末端，比另一條互補鏈長8個～12個鹼基，這是端粒ＤＮＡ分子的結構特徵，是端粒酶識別工作的基礎。　　端粒既有高度的保守性，如原生動物、真菌、植物、動物序列都很相似；又有種屬特異性，如四膜蟲重複序列為ＧＧＧＧＴＴ，草履蟲為ＴＴＧＧＧＧ，人和哺乳動物為ＴＴＡＧＧＧ，等等。　　端粒的功能除保證ＤＮＡ完整複製外，還在維持染色體結構穩定（保護染色體不分解和染色體重排及末端不相互融合等），染色體在細胞中的定位（使之不隨機分布）和引起細胞衰老等方面起著重要作用。眾所周知，真核ＤＮＡ是線性ＤＮＡ，複製時由於模板ＤＮＡ起始端為RＮＡ引物先佔據，新生鏈隨之延伸；引物ＲＮＡ脫落後，其空缺處的模板ＤＮＡ無法再度複製成雙鏈。因此，每複製一次，末端ＤＮＡ就縮短若干個端粒重複序列，即出現真核細胞分裂中的「末端複製問題」。當端粒縮短到一定程度時即引起細胞衰老，故端粒又稱「細胞分裂計時器」。　　2　端粒酶　　端粒酶是一種逆轉錄酶，是一種由蛋白質和ＲＮＡ構成的核糖核蛋白體。其ＲＮＡ成分中含有與端粒ＤＮＡ富G鏈互補的部分，起著合成模板的作用。　　端粒酶具有對端粒的延伸作用，在沒有端粒酶的細胞中，端粒會逐漸縮短直至損害基因；有端粒酶存在的細胞，則該酶會不斷補充新的端粒，使之處於一種不斷伸縮的動態平衡中。端粒酶的另一個功能是修復斷裂的染色體末端。當斷裂的染色體末端有富Ｇ、ＴＤＮＡ存在時，即使沒有完整的端粒重複序列存在，它也能被端粒酶作為引物ＤＮＡ並為之延伸端粒序列。因修復斷端免遭外切酶對染色體ＤＮＡ的更多切割，端粒酶在某種意義上講也維護了基因組的穩定性。此外，在端粒合成中端粒酶還具有去除錯配鹼基的糾錯作用，不僅可以除去錯配鹼基，還可除去延伸超過模板範圍的鹼基。有實驗證實，在嗜熱四膜蟲的小核中，端粒酶還有影響姊妹染色體分離的作用。　　不同物種中端粒酶使端粒延伸的反應具有宿主特異性，即無論此酶來源於何種生物，它催化重新合成的端粒都具有宿主生物的特異性。　　3　端粒、端粒酶與細胞壽命　　細胞衰老是細胞生命活動的必然規律，Hayflick等指出：細胞，至少是培養的細胞，不是不死的，而是有一定的壽命的；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的極限。這就是著名的「Hayflick極限」。Hayflick等還發現，細胞的增殖能力與供體的年齡有關。如從胎兒肺得到的成纖維細胞可在體外條件下傳代50次，而從成人肺得到的成纖維細胞只能傳代20次，提示這可能與成人細胞的端粒長度小於胎兒細胞的端粒長度有關。　　1990年，Harley等人在研究體外培養的人成纖維細胞時，得到細胞衰老過程中端粒損失的直接證據。他們分別取新生兒、24歲、71歲和91歲的供體的成纖維細胞進行體外培養，並使之衰老。結果發現，隨著成纖維細胞的不斷分裂，染色體末端限制性片段（ＴＲＦ）的長度都逐漸減少，而染色體內部的重複序列並不減少。進一步實驗證明，如果細胞不分裂，則ＴＲＦ的長度不減少。說明染色體末端重複序列ＴＴＡＧＧＧ（端粒）在細胞衰老過程中特異地依賴ＤＮＡ複製而丟失。相反，精子中的端粒長度與受試者的年齡無關。這是因為精子中有端粒酶的表達，使端粒保持恆定長度的緣故。所以，端粒的長度被認為是人體細胞壽命的標誌。　　正常體細胞中（生殖細跑、幹細胞及外周淋巴細胞等除外），一般很難測知端粒酶的活性。所以隨著細胞的不斷分裂，染色體末端的端粒序列便會不斷縮短，當人的ＴＲＦ縮短到臨界長度（Checkpoint）5Kbp～7Kbp時，就有信號指令細胞退出細胞周期（Ｍ１），並啟動細胞衰老機制，使細胞出現衰老。如果細胞此時被病毒感染，或某些抑癌基因如Ｐ53、Ｒｂ等發生突變，則細跑可以越過Ｍ１期而繼續分裂。此時端粒酶仍然沒有活性，端粒長度繼續縮短，最終當端粒長度短到極限，即ＴＲＦ為2Kbp～4Kbp時，細跑進入危機期（Ｍ２），這時，由於染色體端粒對染色體的保護作用喪失，染色體不穩定性增加，染色體間出現端—端融合的現象，細胞因而死亡。相反，在有端粒酶活性的細胞中，由於端粒不斷得到補充延伸，因而細胞會表現不死性。　　理論上說，細胞的壽命決定於端粒的長度和端粒ＤＮＡ在體內的消減速度。但有資料表明，有一些動物有較長的端粒而壽命不長，如老鼠的端粒長達50Kbp～150Kbp，而人只有15Kbp，但人比老鼠壽命長得多。在酵母細胞中也發現，酵母細胞分裂24代之後會死亡，但老年細胞沒有發現端粒的明顯縮短［3］。所以端粒對細胞壽命的影響有多大尚難定論。　　4　細胞的不死性　　研究表明：精子等胚性細胞內可檢測出端粒酶活性，因而細胞中端粒的長度穩定而且很長，表現為永生細胞；而在沒有端粒酶活性的細胞中，隨著細胞分裂的進行，當ＴＲＦ長度縮短為2Kbp～4Kbp時，細胞進入危機期（Ｍ２），此時大多數細胞就會死亡。但其中有極少數細胞其端粒酶活性因某些原因被激活，從而使端粒不斷維持在一定的長度而不再縮短，因而穩定了染色體，細胞亦逃過死亡成為無限增殖的細胞——腫瘤細胞。所以許多腫瘤組織和轉化細胞都在不斷細胞分裂中維持穩定而短的ＴＲＦ。　　據羅建新等報道［4］：對43例鼻咽癌患者活檢標本進行檢測，端粒酶活性呈陽性者39例，陽性率達90．7％；動物實驗也證明，端粒酶活性陽性率隨腫瘤的發展過程而增高。此前，日本科學家曾測定了66個原發性胃癌樣品的端粒酶活性，其中85%有酶活性。因此他們認為端粒酶的激活可能是腫瘤形成過程中的一個關鍵步驟。此外，其他的研究者們在乳腺癌、卵巢癌、白血病、結腸癌、肝癌、腎癌中也都測到了端粒酶活性。因此，端粒酶被認為是腫瘤診斷和預防的重要指標。　　大多數事實證明，端粒、端粒酶與細胞壽命直接相關，且端粒酶的激活和表達程度與腫瘤的發生、發展也有十分密切的關係。因此，如何合理地控制端粒的長度，控制端粒酶的激活和抑制，以達到延緩衰老和防癌、治癌的目的，將會是一項意義深遠的、富有挑戰性的工作。

由重複排列的端粒構成的DNA四聯體結構形態恰好類似弦圖結構(目前對端粒的研究表明，端粒是真核生物染色體末端的特殊結構，包含若干的DNA雙鏈重複序列，其末端為含多個G的單鏈DNA.不同物種端粒的重複序列和長度是不一樣的，但每種生物體有其特定的序列和平均長度——如人的端粒為(TTAGGG)n，大約在15kb左右.線狀染色體的末端有一段稱為端粒的特殊區域，由於一般參與複製DNA的酵素無法作用於染色體的末端，因此這些端粒的主要功能，是使細胞能利用一種稱為端粒酶的酵素來複制端粒。如果端粒消失，那麼複製過程將使染色體長度縮小。因此這些特化的端帽能保護染色體結尾不被外切酶破壞，並阻止細胞中的DNA修復系統將其視為需修正的損毀位置。在人類細胞中，端粒是由重複出現數千次TTAGGG序列的單股DNA所組成。這些序列富含鳥嘌呤，可形成一種由四個鹼基重疊而成的特殊結構，使染色體末端較為穩定。四個鳥嘌呤可構成一個平面，並且重疊於其他平面之上，產生穩定的G-四聯體結構。鹼基與位在四個鹼基中心的金屬離子螯合物之間，是經由氫鍵結合以穩定結構。左圖顯示由上方觀看人類端粒中的四聯體，圖中可見每四個鹼基為一組，共三層鹼基重疊而成的單股DNA環狀物。在鹼基環繞的中心，可見三個螯合在一起的鉀離子。也有其他類型的結構存在，例如中心的四個鹼基，除了可以是屬於單一的一股DNA之外，也可能是由多條平行的DNA各自貢獻一個鹼基而形成。端粒另外還可形成一種大型環狀結構，稱為端粒環或T環（T-loop）。是由單股DNA經過端粒結合蛋白的作用之後，捲曲而成的一個大循環。在T環長鏈最前端的地方，單股的DNA會附著在雙股DNA之上，破壞雙螺旋DNA與另一股的鹼基配對，形成一種稱為替代環或D環的三股結構。其中,端粒是由大量串聯的重複序列組成的，其中一條鏈富含G，另一條富含C.端粒合成時先由端粒酶將端粒重複序列加到富G鏈上去，再由DNA聚合酶合成富C鏈.不同生物的端粒G鏈一般都採用緊實結構.而在所有的結構中，G-四聯體是理論上最穩定的結構，它除了可在兩條DNA分子間形成外，還可以在含四段重複端粒序列單鏈DNA中形成.Zahler et al考察了端粒DNA的不同摺疊方式作為引物時對四膜蟲端粒酶的影響.他們發現端粒G-四聯體結構啟動端粒酶延伸端粒的效率最差，不能作為端粒酶的引物，另外，他們的進一步研究發現，端粒酶所需的引物可能不應有任何摺疊.摺疊的端粒DNA結構由於無法作為引物與端粒酶RNA組分鹼基配對、結合，或者改變了端粒引物從端粒酶解離的速度而影響端粒的延伸.目前，所有已知生物的端粒都是在富G的那條鏈上由端粒酶進行端粒合成，因此，能促使或穩定端粒形成G-四聯體結構的物質或方法可能對癌症有潛在治療意義.G-四聯體結構是端粒DNA末端單鏈懸掛在溶液中形成的特殊二級結構，由於它在端粒酶催化延長端粒DNA過程中的重要作用，已成為腫瘤治療和抗腫瘤藥物設計開發的重要靶點。如果藥物能穩定G-四聯體結構或促使其形成，則可使端粒酶不能發揮其逆轉錄酶活性，不僅抑制端粒酶活性而且使端粒不能延伸。而惡性腫瘤需要一定的端粒長度才能維持其生長及增殖，所以通過促成G-四聯體結構的藥物可以達到抑制惡性腫瘤生長的目的。)注:通過穩定G-四聯體結構應該能起到兩個作用,在有腫瘤時可以抑制腫瘤的生長,對於健康人則可以延緩端粒的縮短,有助於延長壽命.這是因為由重複排列的端粒構成的DNA四聯體結構形態恰好類似弦圖結構——實際上DNA結構是在規範場作用下形成的，在能夠雙鏈纏繞的地方則呈雙螺旋，不能雙鏈纏繞則呈現弦圖穩定結構，包括DNA橫檔平均夾角為36度，這都與規範場分布有關係，場越規範越接近穩定的理想黃金分割結構,在不平衡時可以雙向調整，趨於規範分布。金字塔構形的神奇效應也與黃金分割數所約定的幾何結構的特殊性密切相關。對於四聯體端粒，在正常情況下應該越穩定越好，這對於防治癌症有幫助，因為癌症細胞往往對應非正常時機的染色體變異，而在規範場作用情況下，在需要時可打開四聯體結構通過端粒酶實現逆轉錄，不論在「過穩定」問題。G四聯體作為端粒，有點類似十字封手。
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