非小細胞肺癌驅動基因突變與臨床病理特徵的關係

　　作者：陳靈鋒、陳小岩、俞訓彬

　　來源：中華病理學雜誌

　　肺癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其中80%的肺癌為非小細胞肺癌（NSCLC）[1]。與癌症發生髮展相關的重要基因稱為驅動基因，大量臨床研究表明驅動基因突變狀態是靶向治療療效的重要預測因子。近來的一項研究分析顯示根據驅動基因進行靶向治療的患者顯著提高了生存期，總體生存期中位數超過3年[2]。

　　美國國家綜合癌症網路（NCCN）"非小細胞肺癌指南"（2015.V4）明確指出，在進行靶向治療前需要對基因的突變狀態進行檢測，並強烈建議如果存在有效藥物可進行更廣泛的基因狀態檢測，因此對NSCLC患者多基因的聯合檢測可為患者提供更精準的治療，明確各驅動基因在NSCLC中的發生率對臨床實踐具有重要指導意義。

　　我們採用蠍形探針擴增阻滯突變系統（scorpions ARMS）熒光定量PCR法檢測205例原發性NSCLC手術切除組織中表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、HER2和PIK3CA基因突變，總結這9種基因的突變率、分布特點及其與臨床病理特徵的相關性。

　　資料與方法

　　1.研究對象：

　　收集福建省立醫院病理科2013年4月至2015年4月間手術切除原發性NSCLC標本205例。根據2015年WHO肺部腫瘤組織學分類標準分為：腺癌169例（82.4%，包含鱗屑樣、腺泡樣、乳頭狀、微小乳頭狀、實性、浸潤性黏液和胎兒型腺癌），鱗癌30例（14.6%），腺鱗癌5例（2.4%），大細胞癌1例（0.5%）。曾經或正在吸煙55例，從未吸煙150例。具有明確病理p-TNM分期：Ⅰ期103例、Ⅱ期30例、Ⅲ期47例、Ⅳ期9例。標本均經4%中性甲醛液固定處理、石蠟包埋、切片及HE染色，由兩名有經驗的病理醫師進行病理分型，並確定有足夠的腫瘤細胞再行後續檢測。

　　2.儀器與試劑：

　　實驗儀器採用安捷倫科技有限公司的熒光定量PCR儀（Mx3000P美國）。甲醛固定石蠟包埋樣本DNA/RNA共分離試劑盒及EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、HER2和PIK3CA突變基因檢測試劑均由廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司提供。

　　3.組織DNA和RNA的提取：

　　切取3張5 μm厚度石蠟包埋組織樣品，置於1.5 mL EP管內，二甲苯脫蠟後用甲醛固定石蠟包埋樣本DNA/RNA共分離試劑盒提取基因組DNA和細胞總RNA。DNA和RNA分離完畢後，使用Nanodrop 2000測定DNA和RNA的濃度，DNA和RNA的A260/A280均介於1.8～2.1之間。

　　4.蠍形探針擴增阻滯突變系統熒光定量PCR：

　　使用廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司的檢測試劑盒，根據試劑盒說明操作。PCR反應條件為：第一階段：42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1個循環；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10個循環；第三階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36個循環；信號收集：第三階段60 ℃時收集FAM和HEX信號，執行實時PCR。

　　5.統計學分析：

　　應用SPSS 19.0軟體進行統計學分析。採用連續校正卡方檢驗或Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特徵的關係，以P<>

　　結果

　　1.一般情況：

　　原發性NSCLC 205例，年齡27～86歲，中位年齡為62歲，平均年齡61.7歲。9種驅動基因突變總發生率為71.2%（146/205），肺腺癌驅動基因總突變率達81.7%（138/169），分別為EGFR（63.3%，107/169）、KRAS（5.9%，10/169）、PIK3CA（4.1%，7/169）、ALK（4.1%，7/169）、ROS1（3.0%，5/169）、RET（3.6%，6/169）、HER2（1.8%，3/169）、NRAS（0.6%，1/169）和BRAF（0.6%，1/169），如圖1所示。發現兩個基因以上同時突變9例（4.4%），大部分為不吸煙患者（8/9），其中8例為合併EGFR突變，發現EGFR、KRAS和PIK3CA 3種基因同時突變1例。腺癌（P<><>

表1 常見驅動基因突變與臨床病理特徵的關係[例，百分率（%）]

圖1 肺腺癌驅動基因突變分布

　　2.EGFR突變的特點與NSCLC臨床病理特徵的關係：

　　205例原發性NSCLC中EGFR突變率為54.2%（111/205）。同時有第19和20號外顯子突變或同時有第20和21號外顯子突變各1例，第18～21號外顯子的突變率分別為3.7%、52.3%、2.8%和46.7%。EGFR突變更容易發生在腺癌（P<><>

　　3.KRAS突變的特點與NSCLC臨床病理特徵的關係：

　　本組實驗對205例NSCLC樣本同時進行KRAS基因第2號外顯子常見位點突變（34G>T、35G>T、35G>A、35G>C、34G>C、34G>A、37G>T）檢測，基因突變率為5.4%（11/205），以第12號密碼子的突變最為多見（10/11）。突變頻率最高為c.34G>T（p.G12C），佔7/11。在鹼基改變方面，鹼基G→T突變最多見（9/11）。KRAS突變率在實性為主型和浸潤性黏液腺癌更高（P＝0.015），與其他病理特徵無關。

　　4.PIK3CA突變的特點與NSCLC臨床病理特徵的關係：

　　205例NSCLC患者中，PIK3CA突變率4.4%（9/205），以第20號外顯子突變最為多見（6/9）。突變頻率最高為c.3140A>T（p.H1047L），佔4/9；c.1624G>A（p.E542K）佔3/9；c.1633G>A（p.E545K）和c.3140A>G（p.H1047R）突變率較低。在腺癌中，≥62歲、浸潤性黏液腺癌和胎兒型腺癌患者的PIK3CA突變率更高（分別為P＝0.015，P＝0.006），與其他病理特徵無關。

　　5.EML4-ALK、ROS1、RET融合基因的特點與NSCLC臨床病理特徵的關係：

　　205例NSCLC患者中，融合基因總陽性檢出率為9.8% （20/205），其中EML4-ALK陽性率為3.9%（8/205），8例融合類型均為EML4外顯子13；ALK外顯子20、EML4外顯子6 ins 33；ALK外顯子20或EML4外顯子20；ALK外顯子20。ROS1陽性率為2.4%（5/205），5例融合基因均發生在第34號外顯子上，1例同時發生EGFR突變。RET陽性率為3.4%（7/205），7例融合類型均為KIF5B外顯子15；RET外顯子12，1例同時發生HER2突變。ALK、ROS1、RET融合基因總陽性率更容易發生在無吸煙史（P＝0.017）、實性為主型和浸潤性黏液腺癌中（P＝0.012），與病理組織類型（P＝0.390）、性別（P＝0.814）、年齡（P＝0.364）和病理分期（P＝0.179）無關，在腺癌中，EML4-ALK、ROS1、RET融合基因總陽性率發生在EGFR野生型患者中比例為27.4%。EML4-ALK重排更容易發生在病理分期較早和實性為主型和浸潤性黏液腺癌中（分別為P＝0.025，P＝0.014），在女性、年輕、不吸煙腺癌突變率更高，但差異無統計學意義。在浸潤性黏液腺癌ROS1突變率更高（P＝0.049），在年輕、不吸煙且病理分期晚（Ⅲ期和Ⅳ期）的腺癌患者中較高，但差異無統計學意義。RET重排均為無吸煙史患者，與其他病理特徵無關。

　　6.HER2、NRAS與BRAF突變的特點：

　　本組患者中HER2、NRAS和BRAF突變率分別為1.5%（3/205）、0.5%（1/205）、0.5%（1/205），均為腺癌不吸煙患者，其中1例患者HER2突變合併RET重排，1例BRAF突變合併EGFR突變。

　　討論

　　在西方國家，55%以上患者至少含有一個基因突變可能適合特定的干預治療[3]。我們檢測到福建地區肺腺癌常見9種驅動基因總突變率為81.7%，鱗癌總突變率為13.3%，與Wang等[4]的研究結果一致，他們的研究顯示肺腺癌驅動基因總突變率大於82.7%，肺鱗癌驅動基因總突變率大於13%。本研究未包含AKT、FGFR、DDR2等其他未知的驅動基因，提示肺腺癌、鱗癌驅動基因總突變率可能更高。

　　有研究表明東亞人群EGFR突變率為30%～50%，本組NSCLC患者EGFR突變率（54.2%）高於其他學者的研究，可能是本研究中腺癌患者比率高（82.4%）的緣故。本組肺腺癌EGFR突變率63.3%，與國內研究相似[5,6]，與Wang等[4]的研究結果相同，他們的研究顯示肺腺癌EGFR突變率為63.1%。205例NSCLC組織中EGFR突變率在女性、非吸煙和腺癌患者中較高，與既往的研究結果相符[7]，此外我們發現EGFR突變更容易發生於≥62歲患者，與研究[9]結論一致。EGFR突變與病理分期的關係，不同文獻中並無統一結論[6,8]。具有明確分期189例NSCLC組織中，EGFR突變與TNM分期無關，與文獻[7,8]結論一致。具有明確組織分型的154例腺癌中，EGFR突變率在鱗屑樣為主型、腺泡樣為主型、乳頭狀為主型、微小乳頭狀為主型腺癌明顯高於實性為主型和浸潤性黏液腺癌，與Li等[8]研究結果一致。

　　KRAS突變率在白種人肺腺癌大約20%～25%[2]。KRAS突變東亞人發生率較低，KRAS突變多見於肺腺癌，本研究腺癌KRAS突變率為5.9%，與Wang等[4]的研究結果相符。KRAS突變通常與其他驅動基因包括EGFR、BRAF、HER2突變和ALK、ROS1重排相互排斥，但我們發現1例同時發生KRAS和EGFR突變，1例同時發生KRAS、EGFR和PIK3CA 3種基因突變，因此我們認為KRAS與其他驅動基因並非完全排斥，只是概率很低。本組腺癌的KRAS突變高於鱗癌，但差異無統計學意義，與文獻[5]結論一致。本研究KRAS與病理TNM分期無關，男性KRAS突變率高於女性，<>

　　我們研究顯示PIK3CA突變可與EGFR等驅動基因同時發生，與吸煙與否、病理分期不相關，男性突變率大於女性但差異無統計學意義，這與既往研究相符[9,10]，但本次實驗169例腺癌中，≥62歲患者的PIK3CA突變率更高，差異有統計學意義。PIK3CA主要的突變類型為E545K和H1047R[9]，但我們的研究並未得到相同的結論，本研究PIK3CA突變類型以H1047L和E542K為主，提示中國人群PIK3CA主要突變類型可能與西方不一樣。與Li等[8]的肺腺癌PIK3CA突變與組織亞型無關的結論不同，本組PIK3CA突變率在浸潤性黏液腺癌、胎兒型腺癌更高並且差異有統計學意義。

　　ALK、ROS1、RET融合基因總陽性率更容易發生在實性為主型和浸潤性黏液腺癌中，與文獻[11]結論相似。EML4-ALK重排與性別、年齡、吸煙史、組織學類型等病理特徵的關係，不同文獻中並無統一結論[11,12,13]。本組EML4-ALK重排更容易發生在女性、<>

　　綜上所述，我們認為有選擇地對腺癌、女性和無吸煙史患者進行多種驅動基因檢測可提高檢出率，為患者靶向治療提供更多的選擇。因本組病例數量較少，鱗癌、腺鱗癌等驅動基因突變率有待大樣本資料進一步研究。

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