Smad3通過抑制E4BP4介導的NK細胞發育來促進癌症進展 | 文獻精讀

06-28

作者：孫曉晨/秦安

來源：科研小助手公眾號

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背景已知TGF-β影響腫瘤進展。在這裡，我們報告Smad3在調節癌症進展的腫瘤微環境中的另外的作用。腫瘤微環境中Smad3的缺失或抑制抑制兩種同基因小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長，侵襲和轉移。

Smad3-/-骨髓產生NK細胞群體，具有增強的體內腫瘤抑制活性，並促進NK細胞離體分化。我們將E4BP4 / NFIL3鑒定為對NK細胞分化至關重要的直接Smad3靶基因。Smad3以不依賴於T-bet的方式通過E4BP4抑制IFN-g的轉錄。因此Smad3的破壞在體內和體外都增強了E4BP4介導的NK細胞分化和抗癌效應子功能。

此外，用Smad3抑製劑SIS3進行全身治療可有效抑制癌症進展。總之，通過Smad3-E4BP4軸抑制NK細胞介導的免疫監視有助於癌症進展。我們建議靶向Smad3依賴的腫瘤微環境可能是一種有效的抗癌策略。

癌症進展不僅取決於癌細胞的特徵，而且取決於腫瘤微環境。已經提出轉化生長因子-β（TGF-β）在癌發生中起抑制作用，但矛盾的是癌細胞也產生TGF-β1以支持腫瘤發展。癌症細胞衍生的TGF-β可以通過觸發血管生成，上皮 - 間質轉化和基質金屬蛋白酶（MMP）系統促進腫瘤生長以降解ECM（細胞外基質）。

越來越多的證據表明，促進腫瘤發生的微環境是由TGF-β信號促進的。 Smad3是一個關鍵的調解人的TGF-β信號通路，並在TGF-β1介導的轉錄調節中發揮重要作用.Smad3缺陷小鼠表現出粘膜免疫受損和T細胞對TGF-β的反應減弱。

缺少Smad3通過促進Th1分化和粒細胞介導的組織損傷導致嚴重的移植物抗宿主病。 Smad3可以結合Foxp3增強子調節性T（Treg）細胞的發育，並差異調節Treg和Th17免疫反應的誘導。因此缺少Smad3的小鼠具有Treg發育受損。

TGF-β在細胞溶解活性中具有抑制作用，特別是對體外自然殺傷（NK）細胞的干擾素反應性。另外，Trotta等人17闡明TGF-β / Smad3信號通過減少T-bet表達可以抑制NK細胞中CD16介導的干擾素-γ（IFN-g）產生。

據報道Smad3突變小鼠發展轉移性結直腸癌，這可能與慢性炎症有關。相反，最近認為缺乏Smad3的小鼠對化學誘導的皮膚具有抗性致癌作用Li等。這些研究之間的差異進一步描述了TGF-β / Smad信號傳導機制在腫瘤進展中的重要性。

然而，這些研究表明，Smad3可能是一個在腫瘤微環境中TGF-β信號傳導的重要檢查點。

在本研究中，我們通過使用兩個建立良好的同基因小鼠腫瘤模型來證明Smad3依賴性腫瘤微環境在癌症進展中的關鍵作用。缺少Smad3的小鼠被保護免於腫瘤生長，侵襲，轉移和死亡。在Smad3 - / - 腫瘤微環境中的NK細胞群顯著擴大。

這一觀察使我們確定了E4BP4（Nfil3）是NK細胞分化的主要轉錄因子之一，是Smad3的一種靶基因。

因此TGF-β/Smad3信號傳導通過下調E4BP4抑制NK細胞產生促進癌症進展。

Smad3 + / +小鼠的GFP + Smad3 - / - 骨髓重構和Smad3 - / - NK1.1 +細胞過繼轉移到B16F10腫瘤NOD / SCID小鼠。

此外，用Smad3抑製劑進行全身治療可以抑制癌症通過逆轉腫瘤促進體內抗癌微環境的進展。因此，我們的研究結果揭示了Smad3在NK細胞免疫和腫瘤微環境中未被發現的作用。 Smad3靶向治療對於癌症治療的治療潛力也受到牽連。結果1：Smad3對小鼠的癌症進展至關重要

Fig 1 a-h

作者分別在小鼠中注射肺癌和黑色素瘤細胞21天後，可以看到smad3基因敲除的小鼠腫瘤的體積、重量以及生存率均低於smad3陽性的小鼠。

Fig 1 i-p

smad3缺乏的小鼠幾乎檢測不到癌細胞，而smad3+/+的小鼠則爆發大規模肺癌，死亡率達100%。

結果2：Smad3抑制帶瘤小鼠的NK細胞免疫。

Fig 2 a-c

作者接下來研究了缺乏Smad3的小鼠防止癌症生長和轉移的潛在機制。在缺乏Smad3的B16F10帶瘤小鼠中，與Smad3 + / +組相比，發現腫瘤浸潤NK1.1 + NKp46 +和NK1.1 + IFN-g + NK細胞的數量增加了10倍）免疫熒光檢測腫瘤浸潤時t，NKp46t和NK1.1tINF-GtNK細胞在7天收集的B16F10腫瘤。

腫瘤切片染色的代表性圖像抗體識別NK1.1（綠色，上面板），NKp46（綠色，中間面板），抗體（紅色）和IFN-γ（綠色，下部面板）顯示。核用DAPI復染（藍色），和百分比Smad 3/或Smad 3/小鼠腫瘤組織中有陽性細胞(右側)。

雙色流式細胞術顯示B16F10腫瘤中腫瘤浸潤的NK1.1 + CD49b +細胞群。

Western blotting分析檢測NKp46在腫瘤組織中的表達。

Fig 2 d-e

另外，Smad3的缺失也增加了NK細胞的抗癌活性，通過在癌微環境和體循環中局部增加顆粒酶B，白細胞介素（IL）-2和IFN-g的水平

Fig 2 f

相反，用中和抗體從攜帶腫瘤的宿主中消除NK細胞僅在Smad3 - / - 小鼠中恢復了B16F10腫瘤的快速促進，而在體內則不能在Smad3 + / +小鼠中快速促進。

這些發現提示了Smad3在全身性NK細胞發育中的抑制作用，以及NK細胞在Smad3依賴性腫瘤微環境中的關鍵作用。

結論3：Smad3腫瘤微環境來源於骨髓。

Fig 3 a-c

接下來作者將LLC-Luc或B16F10-Luc癌細胞接種到GFP+Smad3+/+和GFP+Smad3-/-嵌合體小鼠中並檢查，可以發現Smad3-/-小鼠中的NK1.1+細胞要明顯多於Smad3+/+小鼠。發現Smad3-/-小鼠的腫瘤體積、重量以及生存率均低於Smad3+/+嵌合體小鼠。Smad3對骨髓來源的NK細胞免疫的抑制作用在體外證實。

結論4：Smad3抑制E4BP4依賴性NK細胞的成熟

Fig 4 a

Western印跡顯示在腫瘤接種後第10天，在Smad3 - / - 小鼠的骨髓來源的和脾NK細胞中，Smad3的缺失都增加了NK細胞定位的重要轉錄因子E4BP4的表達。

Fig 4 b-d

為了檢測TGF-β/ Smad3信號通路在E4BP4中的抑制作用，用TGF-β1刺激Smad3 + / +或Smad3 - / - 小鼠的總骨髓細胞或未接觸脾臟NK細胞3小時，進行實時PCR分析。如圖4b-d所示，TGF-β1顯著抑制Smad3 + / +骨髓細胞和脾臟NK細胞中E4BP4 mRNA的轉錄，當Smad3缺失或用Smad3抑製劑（SIS3）抑制時，TGF-β1的抑制作用減弱。

Fig 4 e-f

雖然CD244 + NKp46 +（未成熟NK細胞）和CD244 + NKp46 - （NK細胞祖細胞）細胞在Smad3 - / - 或SIS3處理的Smad3 + / +骨髓細胞中顯著加速，當敲除E4BP4時這種促進作用減弱（圖4e，f），證明了E4BP4在Smad3介導的NK細胞分化的功能重要性。

Fig 4 g-j

此外，在E4BP4基因的30個非翻譯區（非翻譯區）內發現了轉化的Smad3結合位點（SBS）。物理的通過染色質免疫沉澱（ChIP）測定結果（圖4h，i）顯示，TGF-β1刺激使E4BP4基因的UTR上Smad3的結合增強。

因此，Smad3轉錄抑制E4BP4對TGF-β1的應答，當通過熒光素酶報告基因測定證實Smad3突變時，Smad3被逆轉（圖4j）。這些發現揭示了Smad3在NK細胞發育中通過下調其直接靶基因E4BP4的轉錄發揮抑制作用。

鑒於Smad3的缺陷阻止TGF-β1介導的E4BP4表達抑制，靶向TGF-β1/Smad3-E4BP4軸以加速NK細胞可能增強其在腫瘤微環境中的抗癌免疫力。

結論5：TGF-β1通過Smad3-E4BP4通路抑制NK細胞免疫

Fig 5 a-e

通過將Smad3 + / +或Smad3 - / - NK1.1 +細胞過繼轉移至攜帶B16F10腫瘤的NOD / SCID小鼠中，進一步檢測Smad3對NK細胞介導的抗腫瘤活性的特異性作用。Trotta等最近報道了TGF-β1通過Smad3-T-bet依賴途徑抑制CD16介導的NK細胞IFN-g產生。Smad3-/-NK細胞抗癌作用更多的依賴於E4BP4而不是T-bet。

結論6：靶向Smad3可預防癌症進展

Fig 6 a-d

用Smad3抑製劑SIS3注射Smad3+/+小鼠，15天後進行觀察數據統計，可以看出，隨著劑量的增加，腫瘤體積、重量降低，生存率增加。

Fig 6 e-g

隨著劑量的增加，NK細胞相應的因子也在提升，證明NK細胞數量在增加，起到抑制腫瘤的作用。

Fig 7

SIS3的全身治療也顯著改變了腫瘤友好的微環境，包括抑制血管生成（VEGF表達和CD31 +血管）和腫瘤侵襲因子（MMP-2，MMP-9，MMP-13和CXCR4）用SIS3進行的體外處理也能夠以劑量依賴性方式抑制B16F10黑素瘤細胞的增殖。總結TGF-b對已建立的腫瘤的進展具有支持作用，並且Smad3是規範的TGF-b信號傳導途徑中的關鍵介質。

然而，Smad3在TGF-β1依賴性腫瘤微環境中的潛在作用仍然不完全表徵。在這項研究中，我們證明Smad3對於TGF-β1介導的癌症進展是必不可少的。

因為Smad3的遺傳缺失和藥理學抑制對於癌症生長，侵入和轉移產生顯著抑制，導致小鼠模型中存活率顯著提高LLC肺癌和B16F10黑色素瘤細胞的增殖，增加NK細胞的產生和抗癌活性，但在Smad3敲除或抑制的荷瘤小鼠中發現血管生成，Treg反應和腫瘤侵襲活性降低。

提示TGF-β1介導的促腫瘤微環境可以通過靶向Smad3依賴性腫瘤微環境而轉變成抑制腫瘤的微環境。我們證明了Smad3是TGF-β介導的癌症的重要檢查點在腫瘤微環境中的進展。因此，靶向Smad3依賴性的腫瘤微環境可能代表一種新的有效的抗癌療法。

此外，本研究還表明，Smad3基因的靶向微環境可能代表了一種新的有效的抗癌治療。通過使用一個SIS3，特異性的抑製劑，我們證明了全身治療與SIS3（2.5，5, 10毫克，1克，腹腔注射）成功阻斷腫瘤微環境中Smad3激活並顯著抑制腫瘤的生長、侵襲，在Smad3- /-小鼠中觀察，SIS3處理也通過E4BP4依賴機制明顯增強NK細胞的發育和抗癌活性。

這得到了TH的支持。我們發現SIS3處理可顯著增加tE4BP4表達Smad3 +/+骨髓和NK細胞對NK細胞的發展和逆轉Smad3的抑制作用。

此外，SIS3對癌症進展的抑制作用也與抑制血管生成(CD31和VEGF)和腫瘤侵襲性和轉移活性相關，包括MMP-2，MM的表達P-9，MMP-13和CXCR4。

在體外，SIS3對癌細胞的直接細胞毒性也可能導致SIS3在體內的額外抗腫瘤作用。結果提示SIS3為潛在的癌症檢查點抑製劑。因此系統Smad3的靶向治療可能代表了一種新的、有效的浸潤性癌的治療策略。

總之，Smad3依賴的腫瘤微環境在癌症生長、侵襲和轉移中起著至關重要的作用。TGF-B通過抑制NK細胞PR來建立其腫瘤的微環境，通過Smad3–E4BP4軸誘導和滅癌活性。我們的發現提示通過靶向Smad3調節TGF-β依賴性腫瘤微環境可能是一種有效的抗癌藥物治療，療法，療效。