這篇 Cell 文章告訴你如何研究外泌體 miRNA

06-28

研究外泌體miRNA的文章越來越多，可是高分的並不多。怎麼樣的外泌體實驗結果在審稿人眼中才具有說服力？Epi老師今天帶你們看看這篇最近發表於Cell的外泌體miRNA文章。

肥胖引起的慢性組織炎症是胰島素抵抗和2型糖尿病的根本原因。加州大學的研究者發現外泌體介導的細胞間通訊導致了糖尿病中的代謝紊亂，外泌體攜帶的miRNA參與了糖尿病產生的關鍵機制。

1. 鑒定外泌體

研究者從肥胖小鼠的內臟脂肪組織中分離脂肪組織巨噬細胞ATM，通過超速離心提取外泌體，電鏡和NTA分析；並進一步經過密度梯度離心純化外泌體，鑒定蛋白標誌物。

電鏡觀察外泌體典型杯狀囊膜結構，NTA分析外泌體的粒徑和濃度表徵；Western blot鑒定有TSG101等外泌體蛋白標誌物。

通過這三個實驗，研究者證明ATM細胞確實會分泌外泌體，且已被研究者成功富集。

2. 外泌體轉運能力

Transwell小室實驗

研究外泌體功能，Transwell小室實驗往往是不可缺少的一步，用於證明外泌體從供體細胞釋放後，能到達受體細胞，且外泌體以及它體內的貨物cargo均能被受體細胞吸收。

將Cy3標記miR-233 mimic的轉染進初始巨噬細胞，然後培養於Transwell的上室，下室是不表達Cy3標籤的3T3-L1脂肪細胞。共培養12h後，在下室中觀察得紅色熒光的Cy3-miR-233，是共培養前的6倍，表明這兩種細胞間存在一種介質起了運輸miRNA的作用。

外泌體跟蹤

Transwell小室實驗僅能證明上下兩室的兩種細胞之間確實發生了物質運輸傳遞，但就此說是外泌體發揮的作用的話，還言之過早。我們可以給外泌體加上可視的標記，「看看」外泌體是否進行了細胞間轉運。

從ATM細胞提取外泌體，加上PKH26標籤，添加到3T3-L1脂肪細胞培養基中，12h後，在細胞裡面觀察得到紅色的帶PKH26標籤的外泌體。

外泌體分泌阻斷

利用抑制胞外囊泡的藥物，使細胞減少外泌體的分泌，再來檢測「貨物」的表達水平結果，可為外泌體運輸物質提供強有力的證據。

使用GW4689抑制外泌體釋放之後，miR-233減少，表明是外泌體從ATM細胞轉運miRNA到受體細胞。

3. 外泌體對細胞和動物模型的影響

已經證實ATM細胞分泌的外泌體能夠轉運miRNA到3T3-L1脂肪細胞，接下來可以把外泌體添加到細胞培養基或靜脈注射到動物模型，觀察表型。

從肥胖小鼠ATM中提取外泌體，靜脈注射到正常小鼠中，2周後，發現小鼠的葡萄糖耐受能力、胰島素敏感性、葡萄糖輸注率(GIR)、胰島素刺激的葡萄糖代謝速率(IS-GDR)、肝臟糖產出量(HGP)和循環系統中的遊離脂肪酸(FFA)都下降了，而瘦的小鼠來源的ATM-exo沒有產生影響。表明肥胖動物的ATM細胞產生含miRNA的外泌體，在體內減弱胰島素敏感性。

將上述外泌體添加到多種細胞株的培養基中，24h後可觀察得細胞胰島素敏感性下降，與動物實驗結果一致。

4. 外泌體miRNA測序

已知是外泌體中的miRNA發揮了顯著的作用，可到底是哪些miRNA呢？這時候，就可以通過高通量測序尋找其中起著關鍵作用的分子。

測序樣本：瘦的ATM-exo VS 肥胖ATM-exo。測序獲得的差異表達miRNA中，miR-155曾被報道通過抑制PPARγ，影響脂肪細胞分化，於是研究者選擇了miR-155繼續研究。

5. miRNA的功能

確定研究目標後，下一步就可以開展該目標miRNA的功能研究。

A圖，轉染miR-155 mimic後，細胞葡萄糖吸收量減少；G圖，敲除miR-155後細胞胰島素刺激的葡萄量吸收量上升；但移植骨髓後，miR-155重新表達，使細胞的葡萄糖吸收再次減少。

這項研究發現了脂肪組織中的巨噬細胞會利用外泌體調節全身的胰島素應答。而其他組織例如β細胞、幹細胞或肌細胞等是否有相似的代謝作用，還有待我們探索。文章里進行的實驗都是經典且具說服力的外泌體研究實驗，頗具學習參考價值。

這項研究發現ATM-Exo miRNA存在於旁分泌和內分泌信號通路系統，在這些信號通路中，促免疫和抗炎症ATM可影響遠端組織的代謝事件。

原文： Ying et al., Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro In- sulin Sensitivity, Cell (2017),