掃描電鏡樣品的製備

掃描電鏡樣品的製備　　掃描電鏡(SEM)具有解析度高和景深長等特點，因此圖像層次豐富，立體感強，能夠顯示細胞和組織的三維結構形貌(圖12-13)，因此廣泛應用於生物樣品表面及其斷面微細結構的觀察。　　自1966年第一台商品SEM誕生以來，發展一直很快，儀器本身性能如解析度和多功能等不斷提高外，樣品製備技術也不斷地改進和完善。樣品製備的質量是直接決定SEM能否發揮最佳性能，並拍出理想圖片的關鍵所在。考慮到生物樣品質地柔軟、容易變形、導電性差、二次電子發射率低以及含水量多等特點，在製備SEM樣品時，必須掌握以下原則：　　(1)每一操作過程，都應注意防止樣品的污染和損傷，使被觀察的樣品儘可能保持原有的外貌和微細結構；　　(2)去除樣品內水份，以利於維持SEM的真空度和防止鏡筒的污染。但在脫水和乾燥處理時，要盡量減少避免樣品體積變小和收縮變形等人工損傷；　　(3)降低樣品表面的電阻率，增加樣品的導電性能，以提高二次電子發射率，建立適度的反差和減少樣品的充放電效應；　　(4)觀察組織細胞的表面或內部微結構，應注意和保護樣品的觀察面。　　SEM樣品的製備過程如下：①取材 根據需要，切取適當大小的樣品。專門的SEM備有靈活可動，範圍較大的樣品台，樣品可大些。裝在透射電鏡上的掃描附件，活動範圍較小，樣品直徑應在3～4mm左右。②漂洗 用緩衝液把組織表面洗凈，否則會影響正常形態，但以快速和輕巧為宜，盡量保護器官或組織的表面結構，使其不致因不慎的操作造成人為損傷。③固定 用25～5％戊二醛固定30分鐘或更長時間。Boyde建議用戊二醛固定幾天到幾個月，這樣會增加組織的韌性，減少脫水造成的萎縮。④漂洗 用緩衝液洗3次，洗去未結合的戊二醛。⑤重固定 1％鋨酸固定1～2小時。⑥漂洗 用緩衝液洗去未結合的鋨酸。⑦脫水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％丙酮或乙醇溶液各10分鐘，大於1mm的樣品可脫水10～20分鐘。⑧乾燥 一般情況下，可把脫水後的樣品放在空氣中自然乾燥或45℃熱風吹乾。有些研究工作要求盡量完好保存樣品表面的精細結構，可用真空乾燥法、冷凍乾燥法和臨界點乾燥法等使樣品乾燥。這些方法都比空氣乾燥法效果好，其中臨界點乾燥法優點多，多被研究工作者採用。　　a.臨界點乾燥法原理：在乾燥過程中，表面張力會使樣品變形。因此，為了保持樣品的完好形態，必須消除表面張力造成的影響。我們知道，液體表面張力隨其溫度的升高而急驟變小。對於每一種液體，都有一個表面張力為零的溫度，這個溫度叫臨界溫度。與臨界溫度對應的壓力叫臨界壓力，在臨界溫度和臨界壓力下使樣品乾燥的方法叫臨界點乾燥法。現在，國內外都有商品臨界點乾燥器。照理，含水樣品可以直接進行臨界點乾燥。可是，由於水的臨界溫度高達374℃，臨界壓力高達247×10６Pa(218個大氣壓)，這樣高的溫度和壓力不僅會破壞樣品的形態構造，而且需要耐壓很高的儀器。解決這個問題的辦法就是選擇臨界溫度接近室溫，臨界壓力接近大氣壓的液體取代樣品中的水，然後對這種液體進行臨界點乾燥，使樣品達到乾燥的目的。這種液體叫做轉移液。對轉移液的要求，除要求其適當的臨界溫度和臨界壓力外，還應考慮其毒性、密度、成本和溶劑性質等，一般常用液體CO2。b.臨界點乾燥法的過程：脫水前的處理同空氣乾燥法。中間液替換：因為樣品要從脫水劑(丙酮或乙醇)經中間液過渡到轉移液。因此，中間液既要和脫水劑互溶，又要和轉移液互溶。具體步驟是：脫水後的樣品在70％乙醇(或丙酮)與30％醋酸異戊酯混合液中浸10～20分鐘，然後再在30％乙醇(或丙酮)與70％醋酸異戊酯混合液中浸10～20分鐘，而後用100％中間液(醋酸異戊酯)浸兩次，每次各10～20分鐘。轉移液替換：用CO2作轉移液替換中間液的過程，是在封閉的耐壓室內進行的。用酒精或丙酮清洗臨界點乾燥器的進氣管道和耐壓室，吹乾後，反覆1～2次放入和排出液體CO2，然後在耐壓室底部放數層濾紙，並將裝有樣品的樣品架放入。擰緊耐壓室蓋，慢慢放入液體CO2。然後稍開排氣閥，以5L/min的流量排出耐壓室原來的氣體，此時可聞到醋酸異戊酯味，待醋酸異戊酯味消失後，關閉排氣閥。此時通過觀察窗觀察室內液體CO2應浸沒樣品(如果不能浸沒樣品，說明耐壓室溫度高，應降溫後再行操作)，關　閉進氣閥，停放約1～2小時以完成CO2的置換過程。此時壓力約為56×１０6～64×１０6Pa(57～65Kgf/cm2)。加熱：用60℃溫水或自動調溫裝置將耐壓室加溫，壓力很快增加，使壓力維持在11×１０７Pa(110Kgf/cm2)左右。5～10分鐘，CO2全部汽化，從觀察窗可看到其汽化過程是：液面上升→界面模糊→完全混濁→透亮無液體。這時的壓力約為93×１０6Pa(95Kgf/cm2)。排氣：在排氣管口放一溫水杯，這樣既可觀察排出的氣泡數以控制排氣速度，又可避免排氣管路產生乾冰而造成堵塞。慢慢打開排氣閥，使壓力緩慢下降，並維持耐壓室溫度在50℃左右。排氣速度不可太快，否則會損傷樣品，一般控制在10泡/秒左右［約每分鐘49×１０5～98×１０5Pa(5～10Kgf/cm2)的降壓速度］。大約經一個多小時的排氣後，壓力表指示為「零」，排氣口無氣泡時，即可打開耐壓室，取出已乾燥好的樣品。(5)導電：大多數生物樣品的表面電阻很高，直接用掃描電鏡觀察會產生充放電效應，所以要對樣品進行導電處理。常用的導電處理方法有金屬噴鍍法和導電染色法。金屬噴鍍法是將乾燥後的樣品用導電膠粘在樣品台上，放入真空噴鍍儀內旋轉噴約15nm厚的碳和金，隨後進行電鏡觀察。這種方法除可消除充放電效應外，還可提高二次電子發射率。缺點是熱輻射和原子轟擊會使樣品變形。導電染色法是用金屬鹽類化合物與生物體的蛋白質、脂類、糖類等結合，使表面離子化，或遊離出金屬分子鑲嵌於生物分子間，從而使樣品表面電阻值降低，消除充電放電效應，同時在一定程度上起硬化組織的固定作用。渡部忠雄等提出下面一種方法： [ZB(][BHDWG2,WK7W] 固 定 [BHG18][GP]常 規 方 法 ↓ 丙酮脫水 ↓ ↓ 臨界點乾燥 ↓ 噴 鍍 → ← → 觀 察 → 觀 察 A 液 ↓ 水 洗 ↓ B 液 ↓ 水 洗 ↓ C 液 ↓ 水 洗 導 電 染 色 法 註： A液：2%蔗糖，2%谷氨酸鈉，2%甘氨酸； B液：2%鞣酸； C液：2%鋨酸　　 在固定後脫水前用A液、B液和C液進行導電處理，使戊二醛固定後殘存在樣品組織內的醛基和氨基酸結合，再用鞣酸與樣品組織中的蛋白質、糖和氫結合，同時鞣酸還會和浸入樣品組織內的氨基酸和糖結合，水洗除去多餘鞣酸後，再使鋨酸與樣品組織內的鞣酸螯合，這些金屬螯合物具有優良的導電性能。另外，亦可把脫水後的樣品浸在下述任何一種導電液中數十小時後,漂洗去掉導電液，用導電膠粘在樣品台上後電鏡觀察。幾種導電液配方如下：a.碘化鉀2g＋碘02g＋重餾水100ml＋25％戊二醛10ml＋葡萄糖02g。b.15～3％硝酸銀溶液(01mol/L磷酸緩衝液配製)，避光短期保存。c.溶於70％乙醇的2％醋酸鈾溶液，避光短期保存。e.檸檬酸鈉4g＋醋酸鉛12g＋重餾水100ml，濾過後短期保存，用時加水3倍稀釋。f.5％高錳酸鉀(01mol/L磷酸緩衝液配製)或2～3％重鉻酸鉀(稍加蔗糖)。 圖12-13 牛流行熱病毒感染BHK21細胞的掃描電鏡圖像。在被感染的細胞表面有許多病毒粒子附著或「出芽」 (箭頭)，比例尺為100nm
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