植物多糖對腸道微生態的作用研究進展

摘要：近年來，隨著微生態學的發展，越來越多的學者認識到腸道微生態平衡對人體健康的重要意義。許多研究表明植物多糖作為腸道微生態調節劑，具有調節腸道菌群比例、促進腸黏膜修復、增強腸黏膜分泌型免疫球蛋白表達及調節細胞因子水平等作用。除此以外，植物多糖具有來源廣泛、成本低廉、作用效果好等優勢。本文歸納了近年來報道的具有腸道微生態調節功能的植物多糖及其研究方法和作用機制等，希望為今後的研究重點和發展方向提供參考。隨著微生態學的興起，人們逐漸認識到腸道微生物在人體中的重要性。據報道，人類的腸道菌群主要歸屬為厚壁菌門和擬桿菌門，數量非常龐大。這些細菌參與機體的代謝營養、屏障保護、免疫調節等生命活動。正常條件下，它們彼此相互依存、相互制約，形成一個動態的微生態平衡，使人體處於健康狀態。而一旦有其他因素刺激，如基因突變、環境飲食的改變、精神壓力的增大或服用抗生素、激素等藥物，就會導致菌群失調，引發多種疾病。目前證實和腸道菌群相關的疾病包括神經系統疾病、精神疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病、胃腸道疾病等，並在相關機制方面取得了一定進展。佛羅里達大學的研究學者發現焦慮及抑鬱患者的血漿LPS顯著增加，連蛋白及脂肪酸結合蛋白-2（FABP2，兩者可作為腸道失調及腸道屏障通透性增加的生物標記物）顯著升高，從而得出焦慮與抑鬱可能與腸道失調及腸道屏障完整性受損相關；Sampson等在《細胞》上發表文章認為腸道中特定種類微生物的分泌物會與ɑ-突觸核蛋白（ɑSyn）「攜手」導致帕金森病病發。為了維持腸道菌群的平衡狀態，使機體處於健康水平，相應的微生態調節劑應時而生。微生態調節劑或稱為微生態製劑，是根據微生態學原理，調整微生態失調，保持微生態平衡，利用對宿主有益無害的正常微生物成員或其促進物質形成的製劑，可提高宿主（動物、植物和人）健康水平。中草藥用來治療和預防腸道疾病有著悠久的歷史，近年來的研究證實，某些中草藥或復方製劑可以在一定程度上調節腸道的微生態平衡。多糖是中草藥中重要的組成成分，在中草藥發揮療效的過程中起著不可或缺的作用。本文總結了植物多糖對腸道微生態作用的研究現狀、機制以及方法，以期為相關研究提供理論基礎和指導。1 植物多糖作為微生態調節劑的研究概況多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵連接而成的多聚物，在植物、動物、微生物和藻類中廣泛存在，它不僅是生物體重要的營養物質，也在生物體的生命活動中發揮重要的作用，與蛋白質、脂質、核苷酸並稱為生物體中最重要的四種生物大分子。多糖按照來源大致可以分為五類：植物多糖、動物多糖、藻類地衣多糖、真菌類多糖、細菌類多糖。現代科學研究表明，多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、防衰老、降血糖、降血脂等多種活性，特別是植物多糖，因來源廣泛、毒副作用小、療效持久而備受關注。一些植物多糖如澱粉、纖維素、果膠等，早已作為食品或食品添加劑走進了人們的日常生活中。以前人們對中藥中的活性物質進行研究時，常常忽略其中的多糖成分，認為其無活性。直到上世紀50年代，發現真菌多糖具有免疫調節作用，自此開始了對多糖結構與功能的探究。80年代以後，人們逐漸認識到植物多糖的其他特點，如藥理活性多樣、毒性小等，相應的機制與構效關係也備受科研工作者的關注。已有研究證明，植物多糖如決明子多糖、枸杞多糖、石斛多糖等對腸道微生態有一定的調節作用（表1）。在這些研究中，將植物多糖作為微生態製劑添加到飼料中的研究較多，如一定劑量的多糖能夠對腸道菌群失調的或患結腸炎的小雞、仔豬等動物的腸道菌群進行調節，使腸道微生態恢復到正常水平，或能提高機體抗氧化能力和免疫功能等。其中，多糖所用的劑量不同，所產生的效果也不同。張樹和在對大豆多糖的研究中發現，在BS培養基中添加5%大豆多糖有益於長雙歧桿菌的生長，而2%的添加量作用效果較弱。表1 中藥植物多糖的研究現狀多糖種類腸道模型主要功能參考文獻石斛多糖腸道菌群失調小鼠模型增加小鼠腸道菌群豐富度，提高血清IL-2含量[11]黃芪多糖體外抑菌實驗扶植雙歧桿菌抑制大腸埃希菌，調節微生態平衡[12]太子參多糖免疫抑制小鼠模型提髙免疫器官指數、巨噬細胞吞噬指數、脾淋巴細胞指數、血清細胞因子、slgA含量[13]酸漿多糖腸道菌群的失調小鼠模型促進乳桿菌的生長，抑制大腸埃希菌的生長[14]枸杞多糖腸道菌群的失調小鼠模型扶植益生菌抑制條件致病菌生長[15]納米山藥多糖腸道菌群的失調大鼠模型扶植益生菌抑制條件致病菌生長[16]蒲公英多糖腸道菌群的失調小鼠模型扶植益生菌抑制條件致病菌，降低外周血內毒素含量，提高sIgA與血漿IL-2含量[17]桑葉多糖腸道菌群的失調小鼠模型一定程度上恢復腸道微生態平衡[18]牛膝多糖斷奶仔豬免疫應激模型使乳酸菌、大腸埃希菌、腸球菌維持在正常水平[19]牛蒡多糖正常小鼠顯著增加乳桿菌與雙歧桿菌數量，腸桿菌數量變化不明顯[20]麥冬多糖非糖尿病小鼠模型扶植益生菌抑制條件致病菌，改善糖耐量[21]糖尿病小鼠模型扶植益生菌抑制條件致病菌，緩解糖尿病癥狀，改善糖耐量[22]馬齒莧多糖腸道菌群的失調小鼠模型扶植益生菌生長，提高腸內容物揮發性脂肪酸含量，恢復損傷的腸黏膜[23]決明子多糖斷奶仔豬扶植益生菌抑制條件致病菌，增強仔豬免疫系統功能[24]大蒜多糖正常小鼠增加雙歧桿菌數量，降低腸桿菌數量，對免疫器官無副作用[25]大豆多糖體外抑菌實驗扶植乳桿菌和雙歧桿菌，與低聚果糖作用效果相比差異無顯著性[26]党參多糖腸道菌群的失調小鼠模型扶植益生菌生長，提高乙酸含量，降低血內毒素含量，有效控制移位，促進腸黏膜損傷恢復。[27]金櫻多糖腸道菌群的失調小鼠模型一定程度上恢復腸道菌數量[28]蘆薈多糖實驗性大鼠結腸炎模型顯著下調促炎細胞因子水平，上調抗細胞炎因子水平，緩解結腸黏膜炎癥狀態[29]白朮多糖斷奶仔豬增加腸道微生態區的多樣性[30]SD大鼠脾虛模型改善ERIC-PCR fingerprinting的相似係數，即調整腸道菌群結構[31]甘草多糖肉仔雞扶植益生菌，抑制有害菌大腸埃希菌和沙門菌的增殖[32]山茱萸多糖腸道菌群的失調小鼠模型扶植益生菌生長[33]沙蒿膠多糖菌群人源化小鼠模型增加微生物多樣性，增加HFA小鼠腸道微生物種類以及總菌分配均一性[34]滇黃精多糖糖尿病大鼠模型減少擬桿菌和變形桿菌數量，增加厚壁門桿菌的數量[35]2 植物多糖對腸道微生態的調節機制腸道微生態包括四個部分：（1）腸壁，包括腸道空腔；（2）腸道中的微生物；（3）胃腸道分泌物；（4）進入腸道中的食物。每個組成部分息息相關，任何一個部分出了問題，都直接影響著機體的健康。近年來的研究顯示，植物多糖可以通過修復腸道屏障、調節腸道菌群、調控腸道細胞因子水平等多方面來改善腸道微生態。2.1 修復腸道屏障正常情況下，腸道屏障將腸腔內物質與機體內環境隔離，防止致病性抗原（腸腔內細菌、有毒物質、食物抗原等）侵入腸黏膜下層組織。而當腸道屏障損傷時，腸道中的這些致病性物質便可突破腸道屏障，進而引起細菌及內毒素移位，促進腸原性感染的發生，甚至發展為全身性炎症反應綜合征（SIRS）或多功能器官衰竭（MODS）。有研究報道，慢性或間歇性的膳食纖維缺乏，可使粘蛋白降解菌數量及粘蛋白降解酶CAZymes表達增加，進而導致微生物侵害腸道黏液層，腸道屏障功能出現障礙。植物多糖可以從多方面修復腸道屏障：（1）促進腸道上皮杯狀細胞分泌黏液，保護腸道以免受到潛在損害。Hino等的研究表明低甲氧基果膠不影響杯狀細胞的數量，而是通過上調空腸中的Muc2的表達，直接促進上皮細胞分泌黏液，加強腸道機械屏障。（2）提高細胞緊密連接蛋白的表達，修復損傷的腸道屏障。緊密連接蛋白主要包括ZO家族蛋白（zonulaoccludens，ZOs）、免疫球蛋白超家族蛋白、閉鎖蛋白（occludin）和閉合蛋白（claudins），其中occludin蛋白是最重要的蛋白質分子之一，可以封閉細胞間隙，並與ZO-1等結合形成緊密連接的基礎結構。Jin等報道從靈芝菌絲體中提取的多糖GLP（G. lucidum polysaccharide）能夠顯著上調大鼠迴腸處occludin蛋白以及NF-κB p65、免疫球蛋白sIgA的表達水平。最近的一項研究首次闡述了其中的機制，研究人員將兩種市售益生元菊粉和短鏈低聚果糖，在沒有微生物群的情況下作用於腸上皮細胞，發現這兩種益生元可通過蛋白激酶C（PKC）δ依賴機制，誘導選擇緊密連接蛋白（TJ）的表達直接發揮腸道的屏障保護功能，PKCδ信號是益生元保護腸道屏障完整性過程中所必需的。（3）多糖在腸道菌群的作用下轉化為短鏈脂肪酸（SCFA），SCFA不僅能為腸道上皮細胞提供能量，促進其增殖，維護腸道屏障功能，而且能維持腸道穩態，提高免疫耐受性。Kim等發現，膳食纖維及抗性澱粉能夠被結腸中的特定共生細菌發酵產生SCFA，SCFA可刺激髓系細胞及淋巴細胞增殖，激活腸道上皮細胞G蛋白偶聯受體GPR43，促進免疫，並增強腸道上皮屏障功能，防止入侵的細菌引起炎症性疾病。2.2 調節腸道菌群2007年底，美國國立衛生研究院（NIH）宣布啟動醞釀兩年之久的「人類微生物組計劃」，隨著各國學者研究的深入，腸道菌群與疾病的關係也漸漸清晰。越來越多的研究表明，腸道菌群無時不刻在影響著人體的健康。由於機體自身的酶難以消化從植物中獲取的多糖，需要依靠腸道中的微生物將其降解，反過來不同種類的腸道微生物對多糖的選擇性消化也影響著微生物在胃腸道中的定植和繁衍，因此多糖是一種可行的腸道微生態調節劑。抗性澱粉是一種難以消化的澱粉，常作為食品輔料或膳食纖維強化劑加入到面類食品中。在一項關於抗性澱粉對老年人和中年人腸道菌群影響的研究中發現，老年人的飲食中缺乏抗性澱粉可能會導致腸道菌群失調。如老年人的腸道中變形菌門的含量較中年人多，但通過12周的抗性澱粉補充，這種菌群失調的狀態會得到調節，丁酸的相對丰度顯著增加，大便軟化劑的使用時間顯著減少。無論是中年人還是老年人，抗性澱粉的攝入都會增加腸道中的雙歧桿菌數量。飲食中多樣的多糖成分更有利於菌群的平衡。給小鼠餵食四種不同的飼料，即正常對照飲食、低聚半乳糖 菊粉（GI）、聚葡萄糖 麥麩不可溶性膳食纖維（PF）、GI/PF 1∶1混合飼料，3周後發現，各多糖組合均對腸道菌群結構、多樣性和一些其他生理指標有顯著影響，但僅有GI/PF混合多糖飼料在對宿主產生積極作用的同時未產生明顯副作用，單獨餵食GI和PF，則均階段性造成一定副作用，如菌群多樣性下降，促進產生二胺氧化酶（DAO）和/或氧化三甲胺（TMAO）的Bacteroides和Alloprevotella細菌增多，故糖鏈長短不一的多種聚糖之間可產生協同作用，更好維護腸道菌群穩態，保障宿主健康。2.3調控胃腸道內分泌物水平多糖能夠調控一些細胞因子、白介素以及腸道內激素的分泌。一些細胞因子如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、sIgA、TNF-α和IFN-γ等是評價腸道免疫狀態的重要指標。靈芝多糖GLP能夠顯著提高干擾素IFN-γ、白細胞介素IL-2和IL-4水平，降低二胺氧化酶（DAO）血清水平，從而提高腸道的免疫功能。由香菇多糖、銀耳多糖、茯苓多糖、蟲草多糖和竹蓀多糖組成的複合多糖也可促進動物血清IgG、IgA、IgM、sIgA等免疫球蛋白的分泌，提高體液免疫功能，且對於環磷醯胺所致免疫低下的恢復作用均優於各單一多糖。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）、葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）、YY肽（PYY）、腸促胰酶肽（CCK）和舒血管腸肽等是與血糖的調節有關的腸道激素，一些多糖通過調節這些激素的分泌，也直接或間接的發揮著調節血糖的功能。3 研究方法在研究植物多糖對腸道微生態調節作用的過程中，大體的研究思路和方法為：多糖的製備→動物模型的建立→腸道菌群種類和數量以及免疫指標的檢測。其中對腸道菌群的檢測尤為重要，本文將著重介紹在腸道菌群檢測方法上的一些進展。3.1 常用方法目前常用的方法有傳統培養法、現代分子生物學方法、基於高通量測序技術的宏基因組和16S測序的方法。傳統分析腸道微生物常用平板培養，該方法簡單經濟、技術要求低，但容易受外界條件影響。據報道只有少部分（0.1%~15.0%）腸道細菌能在培養基上培養，種類數量和功能都無法反映腸道中的真實情況。因此，傳統方法需要結合新的技術，才能得到具有說服力的實驗結果。分子生物學技術被應用於腸道菌群的分析鑒定當中，使得人們對腸道菌群的種類數量、生理功能等的了解提升到了一個新的高度。常用的方法為基於分子雜交技術的熒光原位雜交（FISH）、基因晶元技術、基於DNA指紋圖譜的分析方法、基於DNA測序的檢測方法等。這些技術多基於16SrRNA基礎上建立起來的。表2對常用的技術手段進行了比較。表2 四種檢測腸道菌群的16S rRNA方法比較研究方法優點缺點熒光原位雜交技術（FISH）安全，解析度好，不需要額外純化或擴增步驟，即可在自然或人工的微生物環境中監測和鑒定不同的微生物個體，同時對群落組成進行分析只能研究已知序列的微生物進行研究；鑒定到門、綱的分類級別；細菌的自發熒光現象及探針的特異性不足，易導致結果呈假陽性。基因晶元技術高通量、高信息量、快速、樣品用量少、用途廣泛基因晶元的提取純化過程需要手動操作，存在人為誤差，探針的雜交有一定的錯配率，造成假陽性結果，成本昂貴、複雜、無法鑒定亞群。PCR-DGGE技術可重複性、高效、操作簡便，同時檢測多種微生物，在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面顯示出明顯的優越性只能對菌體數量大於總菌量1%的菌群進行分析，結果會受到較多因素的影響，如採樣過程中的無菌操作、樣品預處理過程、引物的選擇、預試驗測定的電泳條件等。實時熒光定量PCR技術（QRT-PCR）特異性強、靈敏度高、重複性好、自動化程度高，可定量到種的水平，可以檢測腸道各菌群的組成及特徵，動態監測腸道菌群的數量變化熒光素種類以及檢測光源的局限性會不同程度地限制實時定量PCR的複合式檢測應用能力。高通量測序技術，定義是「能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的技術」。2006年，Sogin等應用此技術分析了深海微生物，隨後該技術逐漸運用到在腸道微生物領域。從費事、費力、代價高昂的第一代測序，目前已發展到無需PCR擴增放大信號、讀長延長的第三代高通量測序。應用高通量測序技術進行宏基因組以及16S測序，可幫助研究人員更加全面的了解腸道菌群的物種組成、物種間進化關係以及群落多樣性。宏基因組測序的方法還可以在16S測序分析的基礎上進行基因和功能層面上的深入研究。宏基因組學和其他學科如食品科學、代謝組學等的結合，讓人們更透徹的解析腸道「生命密碼」，了解人類疾病與腸道微生物的關係，並通過合理的膳食結構和腸道微生態調節劑來調控腸道微生態的平衡，改善宿主健康。3.2 模式生物目前被廣泛應用於研究的動物有小鼠、大鼠以及豬等。主要通過培育無菌動物或人源化動物，或對這些動物採取化學誘導、基因敲除、轉基因等手段得到需要的動物模型，進而研究藥物對腸道菌群的影響。如給SD大鼠提供高脂飼料製作高脂動物模型，探索蘋果多糖對高脂大鼠腸道菌群、腸道炎症以及腸道組織通透性的影響。最近的研究還發現，秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans），簡稱線蟲，約50%的基因與人類具有同源性。線蟲發育周期短（約3 d），培養方法簡單易操作，所需費用較低，以細菌為食物，包括在人類微生物群中發現的細菌，如大腸埃希菌等，是一種研究菌群與藥物互作的良好模式生物。4 展望多糖作為微生態調節劑效果顯著，但也並不是多糖劑量越高達到的效果越好，過高劑量的低聚果糖/低聚半乳糖的攝入，會導致雙歧桿菌數量增加的同時，丁酸產生菌數量減少，菌群多樣性下降，並會帶來不良血糖代謝，影響人體OGTT水平（口服葡萄糖耐量試驗）。這些研究提示我們，雖然目前植物多糖促進益生菌增殖的作用機制並未完全明確，但其在調整腸道微生態，提高機體免疫等功能上的作用表明，植物多糖可以作為微生態調節劑，並且其有效性和安全性是基礎研究嚮應用轉化過程中的有力保障，但也要知道多糖絕非萬能葯，使用多糖作為腸道微生態調節劑也要注意劑量安全的問題，同時多樣化飲食和多種多糖組合可能會帶來更好的療效，值得進一步探討。諾貝爾獎獲得者Lederberg認為，人是一種由自身細胞和腸道菌群組成的「超級生物體」，腸道菌群參與人體的營養、代謝和免疫過程，影響著人體健康，腸道菌群編碼的基因組也被視為「人的第二基因組」。傳統中草藥能夠與腸道菌群相互作用來調節人體健康。植物多糖對扶植腸道益生菌菌群的生長、改善機體免疫功能、調節腸道微生態等方面有著顯著作用。隨著技術的發展、研究的不斷深入，植物多糖對腸道微生態的調節機制必定會漸漸明朗。現有的微生態調節劑多是益生菌產品，存在活菌數量不易控制、對儲存條件要求較高等特點，甚至一些益生菌被報道能產生耐藥性。而植物多糖作為微生態調節劑，易保存、療效穩定，對其作用機制及相應產品的開發大有可為，值得進一步深入研究和探討。
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