小病毒 大能耐

小病毒 大能耐2013-03-03本文作者：一起剝堅果:09:14|分類：默認分類 |字型大小訂閱作者：貝塔-魚（病毒學博士研究生）說到病毒，大家都不陌生。病毒無處不在，空氣，大海，土壤，南極冰層中都能找到它們的身影。病毒是地球上數量最為龐大的生命形式，如果把地球上的病毒首尾相接，能連成一條2億光年的長鏈。生活在地球上的我們時刻受著病毒的侵襲，每個人身上至少會攜帶四種以上的病毒，常見的種類如腸道病毒、水痘病毒、皰疹病毒和疣病毒等。人在一生中可能被來自各種病毒家族的500-1000種病毒所攻擊，艾滋病，病毒性肝炎，SARS，流感，狂犬病這些刺耳的名字使得人們對於病毒深惡痛絕，病毒性傳染病已經成為最為常見也是人類最難攻克的疾病種類之一，嚴重威脅著人類的健康。然而，病毒的存在也有重要的意義，病毒在生命進化，尤其是免疫系統的進化中起到舉足輕重的作用。同時，隨著分子生物學和基因工程技術的發展，通過基因工程改造，病毒已經成為人們對抗疾病的一大利器。本文將簡要介紹一下病毒這一介於生命與非生命的物質形式，以及病毒在人類疾病治療中的應用。1，人類和病毒抗爭的歷史在人類有記載的歷史中，最早出現的病毒性疾病可能是小兒麻痹症（脊髓灰質炎），相關記敘來自公元前三千七百年時的古埃及，這段象形文字記錄的可靠性還有待進一步考證。然而可以肯定的是，病毒的出現遠遠早於人類的出現。如果想了解生命起源時的地球環境，黃石公園的溫泉可能是最接近當時情境的地點，那裡存在的微生物類群很可能是遠古時代地球上早期生命的近親。科學家在黃石公園的溫泉里發現了古生菌（archaea），這是一類能在惡劣環境里生存的非常古老的生物。而在這些古生菌內人們發現了種類繁多的病毒，這是病毒古老起源的直接證據，由於這些古老的病毒進化相對獨立，對它們進行研究很可能可以追溯到病毒的起源。歷史中，人類不停地在與病毒相抗爭，歷史上記載了多次的流感大爆發，脊髓灰質炎和天花的流行。天花是人類成功戰勝病毒性疾病的一個經典例子。在公元前1000多年前保存下來的埃及木乃伊身上就發現類似天花的痘痕。而我國早在晉代時，著名藥學家道家葛洪在《肘後備急方》中已有記載：「比歲有病時行，仍發瘡頭面及身，須臾周匝，狀如火瘡，皆戴白漿，隨決隨生，劇者多死」。這是世界上最早關於天花的記載。中國在天花防治方面所做出的貢獻是巨大的。據古書記載，我國至遲在十六世紀下半葉已發明人痘接種術，到十七世紀已普遍推廣，這也是人類歷史上最早的人工主動免疫接種預防天花的記載。公元1682年時，康熙皇帝曾下令在全國範圍內種痘。據康熙《庭訓格言》寫道：「訓曰：國初人多畏出痘，至朕得種痘方，諸子女及爾等子女，皆以種痘得無恙。今邊外四十九旗及喀爾喀諸藩，俱命種痘，凡所種皆得善愈」。 公元十七世紀初期，中國接種人痘的技術通過絲綢之路傳入中東，並很快擴散到歐洲。當時的人痘接種有很嚴重的副作用，接種死亡率高達1-2%。十八世紀九十年代，英國醫生愛德華·詹納（Edward Jenner）從擠奶工少得天花獲得靈感，發明了接種牛痘預防天花的方法，由於其副作用小，很快取代了人痘接種，並一直沿用下來。在全世界共同的努力下，1979年10月26日聯合國世界衛生組織在肯亞首都內羅畢宣布，全世界已經消滅了天花病，並且為此舉行了慶祝儀式。天花這種可怕的傳染病終於被人類制服。

2，人們是怎麼發現病毒的？第一個被發現的病毒是一種植物病毒，煙草花葉病毒（TMV）。這種病毒感染煙草植株後，會使得植株出現部分葉肉細胞增大或增多，葉片薄厚不勻，顏色黃綠相間，呈花葉狀。因為這種疾病會嚴重影響煙草植株的生長，很多科學家投入了煙草花葉病原體的研究。

1892年，俄國科學家伊凡諾夫斯基（Dimitri Iwanowski）在研究煙草花葉病時，使用一種可以過濾掉細菌的濾器來過濾含有病原體的液體，卻發現過濾液仍能導致另外的植株生病，他認為這種感染性物質可能是細菌分泌的毒素。1898年，荷蘭科學家馬丁烏斯·貝傑林克（Martinus Beijerinck）在對該病原體做詳細研究後，提出其不是一種微生物，而是一種具有傳染性的可溶性分子，並可在宿主細胞內複製。在隨後發現多種具有相似特性的病原體後，人們將這一類比細菌小、具有感染性和複製性的物質稱作濾過性病毒，簡稱病毒（virus）。中文將其譯為病毒是因為這種病原體可以導致疾病，並且是一種可溶性的傳染分子，所以認為它具有毒性，其實病毒的「毒性」和毒性化學物質的毒性截然不同。

病毒無處不在，我們每天都在吸入和吃入數十億的病毒，我們的基因組中也有病毒基因存在。病毒可以感染各種動植物和細菌，很多病毒還可以跨物種感染。在這個星球上，病毒的數量遠遠大於人類的數量，如單拿人類免疫缺陷病毒（HIV）來說，它的數量就達到了10的16次方。可以說我們生活在病毒的海洋中。病毒的種類和數量如此之多，所幸它們中的絕大部分對人類的健康幾乎沒有任何影響，致病性病毒所佔的比例微乎其微。而在這些致病性病毒中，絕大多數的病毒對人類都是溫和的，它們感染人體後很快就會被免疫系統清除，不會對人體造成傷害。對人類較為危險的病毒數量很少，但它們的危害仍不容小視。3，病毒是什麼？現在認為，病毒是一種專性寄生於細胞內，（僅在細胞內）具有生命特徵，可以自我複製，介於生命與非生命之間的一種物質形式。病毒是介於生命和非生命之間的一種物質形態，原因是病毒並不屬於嚴格意義上的生命，但具有部分的生命屬性。獨立的病毒無法完成任何生命過程，不表現出任何生命特徵，我們可以認為它是一個複合型的大分子物質，是一種物質的存在形式。但病毒一旦進入細胞後就立即表現出活躍的生命特徵，利用宿主細胞的系統進行複製擴增，產生新的病毒粒子，繼續感染新的細胞。同時，病毒還可以同宿主共進化，使自己具有更強的感染能力和更低的細胞毒性，這樣才能夠更好的寄生在宿主細胞內完成生命周期。病毒有多種形態，一般為高度有序和對稱的，如螺旋（棒狀，子彈狀）、二十面體和複合體型，有包膜的病毒往往成球形。病毒非常小，典型病毒的大小處於幾十到幾百納米之間，如引起一般感冒的鼻病毒直徑約20納米，如果你把它排成列，大約需要五萬個才能跨過一個普通的針頭。

相對於細胞生物而言，病毒顯得非常簡單，典型的病毒由一種核酸（DNA或RNA）組成的基因組和蛋白質外殼構成，有些病毒還含有脂質和蛋白組成的包膜。1971年人們發現了一種只含有RNA的病毒，稱為類病毒；1981至1983年，人們又在四種植物RNA病毒顆粒中發現一種伴隨存在的與類病毒相似的RNA分子，其複製和衣殼化都需要依賴於輔助病毒，被稱為擬病毒或衛星。1982年美國生物學家斯垣利·普魯辛納（Stanley Prusiner）發現引起羊瘙癢病的病原體是一種分子量約為27kDa的蛋白質，將它命名為蛋白侵染因子或朊病毒（prion）。朊病毒不含核酸（關於朊病毒是否屬於病毒還存在爭議），可在人類和多種動物里引發可傳播性海綿狀腦病，這是一類致死率極高的中樞神經系統的退行性腦病。4，病毒存在的意義是什麼？大多數人談病毒而色變，但種類如此之多數量如此之大的病毒存在於地球上，也是有其意義的。首先，病毒在生命進化中起到重要作用。達爾文的自然選擇學說給我們提供了一個生命進化的理論，病毒感染對於生命來說就是一種選擇壓力。適者生存，在病毒面前弱不禁風的個體會被淘汰掉，病毒是生物進化的強大驅動力，它們在一定程度上決定著什麼能存活什麼能滅亡。在現代測序技術的發展下，人類基因組已經得到破譯，在人類的基因組中發現了病毒的基因存在，甚至一些具有重要功能的基因可能最初就是來源於病毒，這些證據說明，病毒在生命進化過程中，也能起到正向的作用。

其次，病毒在免疫系統的進化中起到重要作用。在病毒的海洋中，人類能夠生存主要是因為我們擁有一個完善的防衛系統來監視和清除病毒等病原體，如果這個系統出現問題，人體就會變得弱不禁風，這個防衛系統就是免疫系統。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染人體後會破壞免疫系統，在免疫系統崩潰後任何一個普通的感染對人體來說都是致命的，艾滋病的危險性不在於HIV本身，而是感染HIV後的各種機會性感染所帶來的併發症。在生命起源初期是沒有完善的免疫系統的，免疫系統的進化是整個生命系統進化的重要基礎，而免疫系統的進化則是在病毒等各種病原體的刺激下完成的。最後，病毒是食物鏈的重要參與者和支撐者。比如說，在浩瀚的海洋中，病毒的數量大得驚人，一杯海水（大約半升）中大約含有10萬個種類約300億個病毒，病毒每天會殺死海洋中20%的生命物質，釋放其內容物供其它生命體利用，如果海洋中沒有病毒，物質循環中就缺失了一個重要的鏈條，許多生命將難以得到生長繁衍的機會。5，如何研究和改造病毒？1953年4月25日，沃森和克里克在《自然》雜誌上發表他們的DNA結構模型，由此分子生物學進入了快速發展時期，以分子生物學為基礎的許多技術也被建立起來，如分子克隆、基因工程、蛋白質表達純化以及測序技術等，這些技術的建立對生命科學各個領域的發展都起到了巨大的推動作用，當然也包括病毒學。常用的分子生物學實驗技術都可以應用於病毒學研究，這裡不再一一細述。對於病毒學來說，有幾個研究方法特別重要，如分離培養技術，包括病毒的細胞培養模型和動物模型的建立；病毒的檢測技術，包括實時定量PCR和免疫學方法；病毒超微結構的研究方法，包括X-射線晶體衍射、核磁共振、電子顯微鏡等。

【分子生物學技術快速發展，圖片出處依次為：en.wikipedia.org、www.bgitechsolutions.cn】

在病毒學研究中，還有兩個非常重要的概念，分別是感染性克隆和反向遺傳學。在這裡以丙型肝炎病毒（HCV）研究為例，簡單介紹一下這兩個概念的含義。HCV是一種有包膜的RNA病毒，在實驗室中研究病毒首要任務是擴增，通常的方式是將具有感染性的病毒粒子加入合適的細胞系中，經過一段時間的擴增培養後回收病毒，這就需要一直保存著具有感染性的病毒粒子作為「種子」，病毒的保存需要特殊的實驗室和設備，而且具有潛在的危險性。由於存在諸多不便，所以科學家就想了個辦法，先將HCV的RNA基因組反轉錄成cDNA（互補DNA），再把cDNA放進表達載體（一種環形DNA）上，我們就擁有了具有完整病毒序列的基因克隆（當然具體操作過程不是這麼簡單，這裡不做詳細解釋），這種克隆叫做感染性克隆。雖然名叫感染性克隆，但克隆本身其實不具有感染性，當我們需要使用病毒的時候，只需要在體外將DNA轉錄成RNA，然後再用電穿孔轉染等辦法將RNA導入合適的細胞中，經過幾天的培養，真正具有感染性的病毒顆粒就會產生。將病毒做成感染性克隆除了具有安全性外，還具有非常重要的意義：首先易於保存，DNA質粒可以在普通環境中長時間穩定保存，極大的方便了科學研究工作；其次，感染性克隆可以很容易地進行基因工程改造，這是得益於分子生物學的發展，我們現在幾乎可以在基因載體上做任何想做的操作，如引入突變，刪除或者加入片段。假如在病毒基因組上發現了一個突變，想研究這個突變的功能，我們便可以直接通過感染性克隆，在野生型病毒基因組中引入這個突變，得到帶有該突變的病毒，然後再和野生型的病毒進行差別比較，就可以知道這個突變的功能。由於這一技術所帶來的認知路線與由表及裡的經典遺傳學正好相反，所以稱為反向遺傳學。

【感染性克隆和反向遺傳操作，作者製圖】6，如何將改造過的病毒用於人類疾病治療？人類有一些疾病是因為基因功能缺陷或缺失造成的，比如血友病（缺乏凝血因子引起血漿凝結時間延長的遺傳病）和惡性腫瘤（多數惡性腫瘤存在抑癌基因功能缺失）。如果可以採取將外源正常的基因導入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常的基因功能，這便是基因治療。基因治療需要使用合適的載體將外源基因導入靶細胞，而病毒作為專性細胞寄生物，具有靶細胞定向感染性，所以是一種非常適宜的基因治療載體。另外，有些病毒在感染細胞後還能夠將自己的部分基因插入宿主基因組，該部分基因可以同宿主基因一起複制和表達，比如人類免疫缺陷病毒，反轉錄病毒和腺相關病毒等，使用此類病毒作為基因治療載體，可以將外源基因永久導入靶細胞進行表達，從而達到長期的治療效果。

很多病毒都可以作為基因治療的載體，然而，由於病毒感染細胞後具有潛在危險性，如病毒會複製擴增，導致細胞功能異常，引起免疫反應，甚至還會導致細胞癌變，所以任何一種病毒在作為基因治療載體前都需要進行必要的改造，確認無致病作用後才能使用。對病毒改造的主要目的，是在保持其感染性的同時移除病毒複製所必需的基因和致癌基因。如此，病毒在將外源基因插入宿主細胞基因組後，便可以很快被清除掉，保證基因治療的安全性。由於在基因治療方面的諸多優勢，病毒載體得到廣泛使用，截至2005年1月，在已開展的1020個基因治療臨床試驗中，70%以上的治療方案採用了各種病毒作為基因導入的載體。癌症是一類惡性程度高，難以治癒的疾病，由於具有侵襲性和轉移性，晚期疾患死亡率極高，現有的外科手術和放化療對於較晚期的癌症都不能起到很好的效果，然而基因治療為治療惡性腫瘤帶來了一絲曙光。應用溶瘤病毒治療惡性腫瘤，就是近年來興起的一種腫瘤基因治療方法。溶瘤病毒（oncolytic virus）是一類具有複製能力的腫瘤殺傷性病毒，改造過的溶瘤病毒特異識別並感染腫瘤細胞，最終導致腫瘤細胞死亡，同時不感染正常細胞或無法在正常細胞中複製，因而對正常細胞不具殺傷作用，理論上具有更高的抗腫瘤效率和更低的副作用。

常見的溶瘤病毒有細小病毒、呼腸孤病毒，新城疫病毒、水皰性口炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、單純皰疹病毒等，目前已經有多個溶瘤病毒系統進入臨床試驗階段，且療效較為顯著。改造過的溶瘤病毒除了要滿足上述進行常規基因治療病毒載體的要求外，還需要：進一步增強溶瘤病毒的靶向性，使得其能夠特異的感染腫瘤細胞而不感染正常細胞，或者能夠同時感染腫瘤細胞和正常細胞，但僅在腫瘤細胞中發揮作用； 進一步武裝溶瘤病毒，使得其對於腫瘤細胞的殺傷作用加強，如可以在溶瘤病毒中整合入多種抗腫瘤策略； 進一步掩護溶瘤病毒，使得其在發揮強大的抗腫瘤作用前不會被人體免疫系統清除掉，如可以對宿主採取暫時的免疫抑制或者通過其他生物和化學的方法來弱化病毒激發的宿主免疫反應。下面列出了正在進行臨床試驗的溶瘤病（CattaneoR. et al. Nature Reviews Microbiology, 2008 ）病毒名稱臨床應用腺病毒頭頸部的鱗狀細胞癌；前列腺癌單純皰疹病毒多形性膠質母細胞瘤牛痘病毒肝癌新城疫病毒膀胱癌；頭頸部的鱗狀細胞癌；卵巢癌麻疹病毒卵巢癌；神經膠質瘤；骨髓瘤7，用病毒治療疾病靠譜嗎？病毒在人類疾病治療上具有令人矚目的應用前景，但安全性上還需要進行更為全面的研究，特別是病毒感染的靶向性、擴增性、突變性、致病性和宿主免疫系統的反應等。同時，將病毒應用於疾病治療還存在一些亟待克服的缺陷，包括基因導入效率低、外源基因大小限制、外源基因表達不夠長期穩定、感染的靶向性難以控制，基因表達缺乏有效調控以及外源基因插入宿主基因組位置可控性不強等。由於分子生物學的發展，人們對於病毒的生物學特性，基因組結構以及基因表達調控規律等方面了解得越來越充分，對現有病毒的改造以及效用風險評估也越來越嚴謹和合理。相信在不遠的將來，病毒在基因治療上的應用一定會取得突破性進展，小小的病毒一定能夠在人類疾病治療上面大顯身手。8，警示病毒自古以來就和生命體共存亡，它的存在對於生態系統至關重要。對於人類來說，病毒既可以是導致疾病的病原體，也可以成為人們抗爭疾病的利器。但是，許多技術都是把雙刃劍，現在已經可以在實驗室中通過突變篩選的方法得到在人與人之間傳播的高致病性禽流感病毒，而這份研究在發表過程中，也經歷了不少的爭議和波折。在探索未知的同時，也不能忘記對這些研究成果進行相應的規範管理，把對人類社會的潛在風險降到最低。參考資料1， 黃文林主編， 《分子病毒學》， 人民衛生出版社，第二版2， BBC紀錄片， 《地平線——病毒為何致命》3， CattaneoR. et al. Reprogrammed viruses as cancer therapeutics: targeted, armed and shielded. Nature Reviews Microbiology, 20084， 部分資料來源於網路
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