衰老與抗衰老研究進展2

第二節　衰老機理研究進展 　　第一節敘述了曾經提出的一些衰老機理學說，其中許多學說如DNA損傷學說、交聯學說、差錯災難學說等已被廣泛接受，目前仍在研究之中。本節擬就目前研究比較活躍的、對衰老機制具有本源性解釋的衰老機理研究領域作一簡要介紹。 　　一、自由基與衰老 　　人們在40多年前（1956）年就開始注意到自由基與機體衰老的關係了。但對其進行比較深入的研究則是近些年的事情。 　　機體內絕大多數分子是由氫原子（H）和其它基因（以R表示）組成的，常常可以發生R與H的解離，形成各帶一個電子的「R?」與「H?」，稱為自由基（freeradicals）。生物體內常見的自由基有：氧離子自由基（?O-2）、羥自由基（?OH）、過氧化羥基自由基（?OH2）、氫自由基（H?）、有機自由基（R?）、烷氧基自由基（RO?）、有機過氧自由基（ROO?）、脂質自由基（L?）、氧化脂質自由基（L-O?）以及過氧化脂質自由基（L-O-O?）等。自由基性質活潑，極不穩定，容易與其它物質反應生成新的自由基，因而往往都有連鎖反應。自由基的連鎖反應一旦開始，所產生的新的自由基就進一步與基質發生反應，從而導致基質的大量消耗及多種自由基產物的生成。其中基中以?O-2和?OH等活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS）最受人觸目。 　　?O-2和?OH是最活潑也最具危害性的自由基，它們可與其鄰近的任何生物分子反應。研究表明，許多物種?O-2的產生速率與其衰老密切相關，那些?OH和?O-2產生速率低而?OH和?O-2清除機制完備的有機體存活時間明顯較長（Poeggeler等，1993）。H2O2是極易產生?OH的物質，體外以紫外線（254nm）照射H2O2立即可產生?OH，只是半衰期極短難以測定。利用二甲基吡啶氮氧化物（DMPO）可與?OH反應生成穩定DMPO-?OH加合物這一特性，可用順磁共振和高效液相色譜分析共同測定?OH水平。 　　單線態氧（1O2）也是很活潑的自由基，它由三線態氧（3O2）被激發產生。1O2極易氧化還原生成?O12自由基發揮損害作用。1O2本身也具有很大損害作用，光敏染料產生的1O2可引起小腦顆粒細胞的線粒體損傷和DNA鏈斷裂、肌酸激酶的活性抑制，導致神經細胞的能量代謝障礙和死亡。某些老年性的動物失調可能與此有關。 　　適量自由基對於抗局部感染等具有一定作用，但過量自由基則對於不飽和脂肪酸、蛋白質分子、核酸分子、細胞外可溶性成分以及細胞膜等具有十分有害的破壞性作用。機體內從一開始就時刻在產生著自由基。但同時又具有有效的自由基清除系統，維持體內自由基的正常水平，但是，隨著年齡的增長，這種平衡會發生改變。 　　最近的研究表明，體內自由基的產生與腦神經遞質有關。興奮性神經遞質如谷氨酸的釋放可以打開N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體伴隨的鈣離子通道，引起Ca2-內流，若體內谷氨酸濃度過高，Ca2-過度內流，則會觸發?OH和?O-2的過量產生，引起神經損傷甚至死亡（Peruche等，1993）。 　　大量試驗資料已經證明，各種感染，炎症以及其它細胞因子如干擾素（IFN）等都可使體內腫瘤壞死因子（TNF）水平增高，而過量的TNF又使大量的吞噬細胞活化而加強吞噬作用，這可使吞噬細胞過量發生呼吸爆發（burst）而釋放過量自由基，使組織局部及血漿自由基水平過量提高而對機體產生大量自由基而使關節腔內潤滑液中具有潤滑作用的粘多糖發生氧化降解而失去潤滑作用，這是風濕性關節炎發生的重要機制之一。又如過量自由基在血液中的堆積可使細胞嚴重受損，嚴重影響細胞變形能力（erythrocytediformability）使其變硬，加之其表面變粗糙使粘性增加，所以在通過毛細血管時易於被堵形成微栓塞（micro-plugs）(侯穎春等，1994；1995)。這可能是某些老年性心、腦血管疾病的重要發病機制之一。 　　體內產生的自由基極易侵害細胞脂中的不飽和脂肪酸，形成脂質自由基，引起脂質過氧化反應。細胞膜中由磷脂醯基鏈和膽固醇組成的區域在細胞中極性最小，溶解有高濃度的氧，這更有利於脂質過氧化反應的進行。脂質過氧化反應對生物膜內類脂結構破壞性極大，反應中產生的自由基可以不加區別地與細胞中其它物質如蛋白質和核酸作用，造成酶、染色體DNA分子功能或結構的破壞。過氧化脂質反應的產物丙二醛（MDA）又可通過蛋白質一級氨基基團反應與蛋白質交聯，造成細胞功能的破壞以至死亡。衰老相關疾病的發生及藥物、毒物引起的機體損傷與此機制密切相關。基於這個原理，利用外源性毒物如百草枯、H2O2、Kainate、細菌脂多糖等造成自由基損傷的動物模型，利用這些模型可進行一系列自由基與衰老、疾病以及抗自由基藥物方面的研究。 　　自由基對蛋白質的不利影響是其對人體危害的最重要方面，這可從兩個方面去理解：首先是自由基直接對蛋白質的氧化破壞和引起的交聯變性，這是衰老形成的重要原因之一。對蛋白質直接破壞的後果主要有：（1）可使酶蛋白失活成為另一種催化錯誤反應的酶；（2）出現某些具有異質性的蛋白質，從而引起自身免疫反應的靶子；（3）自由基可使結締組織結構蛋白髮生廣泛交聯，使其理、化性質發生改變，導致血液和組織間的交換減少，使其中的器官組織加速衰老退化。同時這些變性結締組織原有的功能也部分甚至全部喪失了。自由基對蛋白質不利影響的第二個方面是對核酸的氧化和交聯，使DNA發生斷裂、突變以及對熱的穩定性發生改變等，從而嚴重影響了蛋白質遺傳信息的正常轉錄、翻譯過程，使蛋白質表達量降低甚至消失，或者產生突變蛋白質。這種影響反映在酶蛋白和激素、免疫活性物質等重要蛋白質時其影響範圍就更大，後果就更嚴重。而蛋白質合成減少是老年性記憶力減退、智力障礙以及肌肉萎縮等表現的重要原因之一。總之自由基對蛋白質的影響涉及面很廣，後果嚴重而複雜，乃是自由基與衰老聯繫的重要紐帶。 　　隨年齡的增長，人體內自由基水平呈增長趨勢，同時自由基清除機制卻呈退化趨勢，結果造成體內自由基大量積聚。所以自由基對機體健康的危害作用漸趨嚴重，引發了機體多種生理功能的障礙，促進了多種老年疾病（如動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、腦神經細胞變性、糖尿病以及腫瘤等）的發生、發展，導致機體的衰老，直至死亡。 　　在整個衰老過程中，自由基引起大量的細胞衰老、死亡，近年來已有大量資料表明這些細胞的衰老、死亡許多屬於自由基引發的細胞凋亡（apoptosis）。 　　二、細胞凋亡與衰老 　　死亡是生命過程中的一個組成部分，機體死亡歸根結底是細胞的死亡，而細胞的死亡有兩種不同的方式，即壞死（necrosis）和凋亡。細胞凋亡即程序化細胞死亡（programedcelledath,PCD），它有別於細胞壞死，因為細胞凋亡是一種重要的生理學現象，它是一個主動的、有控的、在調節機體細胞群數量上起和有絲分裂互補作用的過程。細胞的衰老性死亡就是細胞凋亡。不容置疑，細胞凋亡與衰老密切相關，它就是機體衰老過程中具體到細胞水平的體現。問題是衰老過程中細胞凋亡是如何被啟動和調控的？這才是亟待探討的課題。 　　許多研究資料已經表明，體內過量自由基特別是ROS的堆積與細胞凋亡率的上升具有密切關係，這可能是自由基之所以與衰老的老年退行性疾病關係十分密切的主要機理。自由基特別是ROS主要多產於那些具有重要功能、高度活動並有高耗氧量的組織細胞，如腦細胞、神經細胞、心肌細胞以及具有內分泌功能的腺體細胞等，結果可使這些細胞局部的自由基水平遠高於其它組織細胞局部，使前文已述及的那些自由基對機體的有害作用機理特別是對核酸的蛋白質的損傷機理高度啟動，結果使這些組織細胞調亡率增高。ROS之所以在這些組織細胞局部堆積與ROS的下列產生機理有關：（1）這些組織高度活躍的需氧代謝使其線粒體呼吸鏈消耗氧的產物量很高；（2）過氧化物酶體產生大量過氧化氫產物；（3）激活的吞噬細胞「呼吸爆發」（burst）產生大量ROS；（4）細胞色素P450酶的誘導。 　　抗氧化劑的缺乏使ROS等自由基的水平更高，導致細胞內DNA、蛋白質、脂膜等的損傷，誘導細胞凋亡。許多實驗發現多種細胞系暴露於低劑量H2O2（10-100μmol/L）時可發生細胞凋亡，有人以低於10μmol/L的H2O2處理胸腺細胞10分鐘即發生胸腺細胞的普遍凋亡，並隨H2O2劑量的增加其調亡率也明顯增加。 　　自由基也是許多生物活性物質如細胞因子TNF、IFN、GM-CSF（粒細胞、巨噬細胞克隆刺激因子）以及IL（白細胞介素）等作用過程中引起細胞凋亡的介導物。 　　但是，過量自由基引起細胞凋亡的分子機理的諸多環節仍需研究。 　　除自由基外，各種其它病理性刺激都可激發細胞凋亡的啟動，如輻射、有害物質、DNA突變以及內環境的許多變化等等。但這些因素啟動細胞凋亡的具體分子機制尚有待進一步研究。 　　細胞凋亡時最突出的特徵是細胞DNA的有控裂解，這種裂解是一種鈣鎂依賴性核酸內切酶被激活後對細胞DNA在核小體與核小體之間的不斷地切斷，結果產生若干大小不等的寡核苷酸片段，電泳時形成所謂的「梯形電泳譜帶群」。有許多研究資料顯示這種有控裂解程序的啟動與「細胞凋亡相關基因」有關。 　　毫無疑問，凋亡信號是通過一系列細胞信號傳導系統而被細胞接受的，它與細胞增殖信號交錯形成複雜的網路，最終結局還需調節系統的調節。許多研究結果已經表明，原癌基因c-myc和c-fos的表達對於細胞凋亡的啟動可能是必需的。有研究結果顯示，c-myc的高表達可同時刺激細胞分裂和調亡，但向何種趨勢發展尚取決於是否存在其它關鍵性生長刺激物，如果存在，c-myc即發揮原癌基因的作用而使細胞加速繁殖，反之，則啟動細胞凋亡程序。作為調控系統的一員，細胞中也存在抑制凋亡的原癌基因如bcl-2,它只抑制細胞凋亡但不象c-myc和c-fos那樣可以刺激細胞增殖。研究發現bcl-2多位於細胞內氧自由基產生較多的位置如線粒體、內質網和核膜等，這與細胞的抗氧化自我保護不無關係。已經發現bcl-2抑制細胞凋亡可以是由於它編碼的26Kda蛋白，該蛋白可以強有力的抑制副射、激素、細胞因子以及抗體等對細胞凋亡的啟動作用，這表明其可能阻止多種凋亡途徑中的某個共同環節。P53是研究相關多的一個腫瘤抑制基因，對P53的誘導表達可以提高細胞凋亡率（如腫瘤細胞凋亡率）。總之，以上基因在凋亡控制作用中起不同作用，其對機體利弊因場所和作用對象不同而異，但就正常體細胞的凋亡來講，它們和衰老與抗衰老緊密地聯繫在一起，這些聯繫的許多機制還需進一步研究。 　　三、線粒體NDA突變與衰老及退行性疾病 　　人類線粒體DNA（mtDNA）全長16569bp，為一閉合環狀雙鏈（輕鏈和重鏈，都有編碼功能）超螺旋DNA，存在於線粒體基質中。人體不同類型細胞含線粒體數不同，有的含數百個甚至上千個，有的則不含線粒體如成熟紅細胞。每個線粒體中有2-10個mtDNA分子，mtDNA基因組含有編碼兩種rRNA(12S和16S)、22種tRNA及細胞氧化磷酸化有關的13條多肽鏈（細胞色素B和C、氧化酶I、Ⅱ、Ⅲ亞單位、ATP3亞單位6和8兩部分以及呼吸鏈NADH脫氫酶的7個亞單位即ND1-ND6以及ND4L）的原因。 　　MtDNA的內共生來源、胞體定位以及多拷貝等特點使其具有獨特的遺傳學特性；半自主自製、母系遺傳、數量遺傳性狀（即異質體和閾值效應）。異質體是指在一個細胞內同時存在正常的與突變的兩種mtDNA；閾值效應則指只有突變型mtDNA數目達到一定限度地，才足以引起器官或組織的功能異常，這一限度即為閾值。 　　與核DNA（nDAN）相比，mtDNA的特殊性有：（1）mtDNA裸露無組蛋白保護且缺乏有效的修復系統，因此其突變率遠高於nDNA（約為其10～100倍）並且在細胞內不斷積累；（2）mtDNA具有極其經濟的基因排列，既無內含子又有部分區域基因重複使用，因此任何突變都可能成為造成重要功能缺陷的病理性突變，但由於其異質性，突變型和正常型mtDNA拷貝數比值需達到一定閾值時才導致出現異常臨床癥狀、體征。 　　近年來，mtDNA突變相關疾病不斷地發現，但突變類型大致可分為鹼基替換突變和重組突變兩種。如果從突變的細胞系來看又可分為生殖細胞系突變和體細胞系突變。 　　1．生殖細胞系突變 　　mtDNA主要為母系遺傳，所以，這裡的生殖細胞系突變主要指女性生殖細胞系突變，任何可能發生的mtDNA突變均可涉及人類女性生殖細胞系，其中以鹼基替換突變最為常見。 　　生殖細胞內mtDNA發生突變後出現下述過程：當生殖細胞內mtDNA發生突變時，可造成細胞內突變型與野生型mtDNA同時存在（即異質體），隨後，突變型與野生型mtDNA通過減數分裂和有絲分裂隨機分布到子代細胞中，結果細胞中突變型與野生型mtDNA的比例發生隨機增減（稱為遺傳漂變），最後，再分裂的子代細胞有朝著全部為突變型或全部為野生型mtDNA（即同質體）的方向發展的趨勢，這一過程稱為「複製分離」。 　　隨著複製分離和遺傳漂變的發生，一些mtDNA中「中性突變」（對機體無害也無益、選擇作用不明顯的突變）可以建立起同質體而以一定頻率保留於人群中，形成mtDNA某些區段的多態性。與之相反，重度有害突變因複製分離造成的同質體個體發病早，極易隨自然選擇而消除，很少成活下去，所以多數重度有害突變無法建立起同質體，其發病者多為新出現的異質體表型，介於上述二者之間的為輕度有害突變，它對繁殖後代影響不很嚴重，可在人群中建立起低頻度多態性，但這些個體因具有氧化磷酸化（OSPHOS）能力的缺陷而過早發生退行性疾病。 　　近年來研究已經發現某些疾病與mtDNA鹼基替換突變有關。如Lerbe氏遺傳性視神經病（Lerbe』shereditaryopticneuropathy）是mtDNA第11778位G轉為A面使NADH脫氫酶第四亞單位ND4的第340位精氨酸殘基被組氨酸殘基取代，還有多個位點的突變對本病的發生起作用。又如線粒體腦肌病（mitochondrialmypathy,encephalopathy）伴高乳酸血症（lcticacidosis）和卒中樣發作（stroke-likeepisodes）患者和成年型糖尿病伴耳聾患者，其mtDNA發生tRNALeu基因第3242位A→G替換突變。 　　2．體細胞系突變 　　體細胞系mtDNA突變與氧自由基損傷關係密切。呼吸鏈反應（呼吸爆發）是產生氧自由基的重要來源，線粒體正是這一過程的重要場所，而且mtDNA缺乏修復能力，所以，mtDNA很易被自由基損傷並不斷積累。年齡相關的體細胞mtDNa突變的積累與隨增齡而出現的OXPHOS能力下降密切相關。 　　體細胞系mtDNA突變即可能是鹼基替換突變也可能是重組突變，重組突變又以片段缺失最為多見，缺失片段的長度及佔總mtDNA的量決定了其產生影響的大小。近年來發現的mtDNA缺失類型已有十幾種，不同的缺失類型有不同的組織特異性，其中骨骼肌、腦、心肌等是發生缺失較多的組織。有資料表明，mtDNA缺失突變引起的疾病常常是散發的，無家族史的，發病率隨年齡而增加，這從反面說明了mtDNA缺失突變多為體細胞突變。 　　體細胞系mtDNA突變與生殖細胞系mtDNA突變所產生的生理效應相加，如被遺傳的有缺陷的mtDNA越少，則引起發病所需體細胞mtDNA的損傷就越多，由此引起有關的器官衰竭所要求的mtDNA損傷積累需要的時間也越長；反之亦然。也就是說，年齡相關的mtDNA突變的積累所致的分裂後組織的OXPHOS功能的漸進性喪失會增加遺傳缺陷所造成的OXPHOS缺陷，這可能是造成某些線粒體疾病晚發病及漸進性加重的原因之一。 　　（二）mtDNA突變與衰老及與年齡相關的退行性疾病的關係 　　體細胞系mtDNA突變的積累與人類組織器官（腦、心肌、骨骼肌、皮膚、肝、卵母細胞及精子等）衰老、機體衰老及許多老年性退行性疾病密切相關，Wallace等發現，40多歲的正常人的心臟及腦有5kb、7.4kb片段缺失，缺失頻率隨增齡而增加。許多資料證明，mtDNA突變隨增齡而積累，機體壽命與基礎代謝率呈反比而與氧自由基清除率呈正比。這均說明隨增齡而OXPHOS功能的下降可能是mtDNA氧化損傷積累的結果。 　　1．MtDNA突變與老年心血管疾病 　　在心血管疾病方面，已經發現擴張性心肌病和肥厚性心肌病均存在mtDNA片段缺失和點突變，有的甚至可見多個片段缺失，缺失常位於ATPase6和D環區的7.4kb片段缺失。研究提示mtDNA突變與衰老、心肌缺血、老年心衰及「老年心臟」等老年性心臟疾病的發生有關，主要是mtDNA片段的缺失。衰老心肌中mtDNA片段缺失和OXPHOS中酶活性下降可能導致自由基介導的脂類過氧化反應加速，這可能是形成動脈粥樣硬化斑塊的原因之一。 　　2．MtDNA突變與老年中樞神經系統的退行性改變及疾病 　　中樞神經系統的退行性改變及疾病是老年人的常見疾病。研究資料提示Parkinson病（PD）、Alzheimer病(AD)和Huntington病（HD）是中樞神經系統與OXPHOS缺陷關係最為密切的幾種退行性疾病，均有不同程度的mtDNA突變。 　　PD是一組以運動失調為主的臨床綜合症，其黑質紋狀體內多巴胺神經元變性是主要病理特徵。研究發現PD患者腦細胞呼吸鏈複合物I活性下降，黑質尤為明顯，其複合物I的mtDNA編碼亞單位減少。患者mtDNA有5.0kb片段缺失，發生率約為對照組的10倍，而且，不論患者的腦組織還是肌組織其約粒體均存在異質體，這提示當缺失型mtDNA數量超過一定閾值時才會發症。 　　AD是一類以漸進性痴呆和腦皮質萎縮為主要特徵的老年性疾病。許多研究曾集中於β-澱粉樣前體蛋白的基因突變與β-澱粉樣前體蛋白成份的異常，但這類病例只佔患者的很少一部分。目前的研究表明mtDNAT突變和OXPHOS缺陷可能是該病的一個重要原因。Parker等（1992）發現6例AD患者中5例存在複合物IV的OXPHOS缺陷。也有研究發現AD患者腦新皮質勻漿中存在OXPHOS偶聯缺陷並有mtDNA點突變及缺失突變，因此，AD的發展在某種程度上與mtDNA突變及OXPHOS缺陷有關，其中包括觸小體的退行性變。 　　HD是以成年期發病的運動失調和漸進性痴呆為主要特徵的常染色體顯性遺傳病，病理特點是基底神經節的退行性變。在HD患者腦中發現豆狀而非皮質中複合物IV的缺陷，血小板線粒體有複合物I的缺陷。HD表現一定的母系遺傳化傾向。這些資料表明，HD的發生、發展可能與mtDNA突變有關。 　　3．MtDNA突變與非胰島素依賴型糖尿病 　　非胰島素依賴型糖尿病是一種年齡相關性疾病，是老年人最常見的一種內分泌系疾病。本病也出現退行性疾病特徵，其發病與線料體OXPHOS功能缺陷有密切關係。線粒體的OXPHOS在葡萄糖誘導胰島β細胞分泌胰島素過程中起重要作用。研究表明，成年期糖尿病患者存在mtDNA的異質均有異質體10.4kbmtDNA片段缺失，缺失位於4389-14812位點之間，缺失部分包括L鏈起點（O2）和除rRNa、ND1部分cytb和相鄰的RNA外的所有mtDNA編碼基因。缺失後的mtDNA分子小因而具有自製優勢，易於在細胞內聚積而使異質體達到閾值效應。 　　由於編碼呼吸鏈的一些基因缺失，故OXPHOS功能逐漸下降，能量來源表現不足，胰島分泌能力下降，從而誘發糖尿病。一些非胰島素依賴型糖尿病患者表現為mtDNA的點突變。如mtDNA3243位A→G突變，不僅影響了tRNALeu的合成，還累及轉錄終止因子的結合，造成線粒體蛋白的合成不足，影響了ATP的生產，這一突變的母親遺傳傾向較大。 　　MtDNA突變的後果是十分嚴重的，不僅導致衰老並可引發多種疾病，儘管造成這些惡果的原因可能是多方面的。但是，由於mtDNA突變所致的呼吸鏈有關的酶類出現異常以及OXPHOS功能異常是不可忽視的因素，因為mtDNA編碼的蛋白質亞基都是ATP生產有關的，而線粒體在細胞能量供應及維持細胞正常代謝和功能方面是舉足輕重的，所以，不難理解其與機體衰老和退行性疾病的密切關係。 　　目前，對於mtDNA突變已經可以用PCR、Southern雜交、電鏡等手段來有效地予以檢測，已經提出一些可能的治療線粒體疾病的方法，如補充呼吸鏈中的輔助因子、增加可氧化基質以及抗自由基損傷等，輔酶Q已經用於某些老年性退行性疾病的治療，mtDNA基因的導入、含正常mtDNA基因型細胞的再增殖、導入以及融合等均有可能成為mtDNA突變性疾病的基因治療手段。
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