CellMax 細胞大課堂1-2 l 細胞增殖檢測實驗一文掃盡

來自專欄細胞培養俱樂部

細胞增殖檢測實驗的意義

細胞增殖是指細胞在周期調控的因子下，通過DNA複製等反應，完成細胞分裂的過程。增殖檢測一般是分析，分裂中的細胞數量的變化，進而反應細胞的生長狀態及活性，目前廣泛應用於腫瘤生物學，分子生物學，葯代動力學等領域。

腫瘤細胞增殖和轉化過程

細胞增殖檢測實驗的分類

細胞增殖檢測實驗根據實驗方案和目的不同分為以下幾種：

1. 細胞代謝活性檢測 通過檢測活細胞相關的物質的含量（如蛋白質、酶）等間接地測定待活細胞的數量來評價細胞的增殖能力。

• 特點：間接的方法，反應的是細胞活性而非是否在增殖；
• 常見實驗舉例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；
• 應用：細胞活力、藥物作用的毒性，適合高通量分析實驗。

2. 細胞DNA合成檢測 通過測定細胞的DNA合成含量來評價細胞的增殖能力。

• 特點：直接測定DNA合成是檢測細胞增殖最準確方法；
• 常見實驗舉例：BrdU和EdU；
• 應用：細胞DNA修復，分化及細胞標記物追蹤等。

3. ATP濃度檢測 利用熒光素酶Luciferase反應細胞ATP的含量，進而反應細胞活性。

• 特點：結果靈敏；
• 常見實驗舉例：熒光素酶催化反應；
• 應用：高通量細胞增殖檢測和篩選。

4. 細胞增殖相關抗原檢測 通過檢測增殖細胞特異性地表達某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作為人體細胞增殖的標誌。

• 特點：反應體內腫瘤細胞的增殖能力，但是需組織切片不適合高通量；
• 常見實驗舉例：細胞增殖的標誌物的免疫組化等；
• 應用：體內腫瘤組織。

5. 染料排斥法 活細胞有排斥某些染料如伊紅、台盼藍、苯胺黑等的能力，而死細胞由於膜完整性的破壞，可被著色。適合少量細胞的統計，廣泛用於繪製細胞生長曲線等。

其中，基於細胞代謝活性的檢測包括：酶活性如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB實驗。又可統稱為比色法，主要基於顏色的變化來反應細胞數量，十分適合高通量藥物篩選，進而計算藥物的IC50。

一、細胞代謝活性檢測

A. MTT、MTS、CCK8等

這一類的實驗原理基本類似，細胞線粒體的脫氫酶可將MTT、MTS、CCK8等試劑還原為有色產物，可在酶標儀上於不同波長（490nm、490nm、450nm）處檢測OD值，在一定範圍內，吸光度值與活細胞數目成正比，進而反應細胞數量。

MTT是最早出現的檢測方式，於1983年由Mosmann建立的方法，MTT為四唑鹽，但是存在一定的缺陷，特別是還原產物不溶水，且對細胞有較大毒性，因此限制了其使用，目前基於MTT開發的MTS、CCK8等，應用更加廣泛。

MTT對細胞的毒性：

A圖為剛加入MTT（0.5mg/ml）NIH-3T3細胞形態，B圖為加入MTT後4h，細胞形態發生了明顯改變[1]。

如下為MTS的原理：MTS被乳酸脫氫酶還原為黃色的Formazan

1. MTS的操作步驟：

1. 細胞接種到96孔板培養；

2. 37℃培養箱培養幾天；
3. 培養完成後，每孔加入MTS和PMS（20:1比例）混合溶液後繼續孵育2-3h，現在大部分公司提供的商品化MTS已處理好可以直接加入進行檢測；
4. 終止培養，使用酶標儀，在490nm處測定吸光度值；

注意：避光操作。為了保證實驗結果有良好的線性，MTS實驗中吸光度值應保持在0.75-1.25之間較好；腫瘤細胞一般要根據其生長速度及本身代謝情況進行鋪板。

優點：

1. 操作簡單，比MTT高效，產生水溶性的Formazan，無需用DMSO溶解；
2. 由於MTS被還原產物顏色較深，吸光度值變異範圍大，使測定更加敏感準確；
3. 快速，作用時間2-3小時為最佳，而MTT需4小時；
4. 重複性好，還原產物穩定。

2. CCK8法的操作步驟：

1. 細胞接種到96孔板培養；

2. 培養完成後，每個孔中加入10μLCCK8試劑；
3. 37℃培養箱中孵育1-4h；
4. 使用酶標儀，在450nm處測定其吸光度值。

優點：

1. 使用方便，檢測快速；
2. 靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；
3. 對細胞毒性小；
4. 產物水溶性，不需換液，尤其適用於懸浮細胞。

缺點：與MTT相比，CCK-8和MTS的價格貴。

注意：避光操作。

B. SRB比色法

SRB磺醯羅丹明B(Sulforhodamine B)，一種粉紅色陰離子染料，在酸性條件下可特異性地與細胞內鹼性氨基酸結合；在540 nm波長下產生吸收峰，在一定範圍內，吸光度值與活細胞數目成正比。

實驗步驟：

1. 從培養箱中取出培養好的待檢測細胞量的96孔板樣品；
2. 每孔加入TCA（50%的三氯乙酸）固定細胞，4℃放置1h；
3. 棄去固定液，蒸餾水洗5-6次，室溫晾乾或吹風機吹乾；
4. 每孔中加入SRB染液100μL，室溫放置10-30min；
5. 棄去染液，用1%醋酸洗滌，直至在白色紙上倒扣輕拍無明顯染料顏色；
6. 每孔加入150μLTris溶液；
7. 用酶標儀在515nm處測定吸光度值；

注意：SRB實驗結果中OD值在0.8-1.2之間時線性較好；腫瘤細胞一般要根據其生長速度及本身代謝情況進行鋪板。

優點：不存在孵育時間限制，即細胞固定後可以放置較長時間；與MTS,CCK8相比，檢測時間可以自己掌握，不受限制，更適合大規模試驗。

缺點：操作步驟繁瑣，不適合懸浮細胞。

如下圖，圖A表示肺癌細胞系H441細胞數量與SRB染料對應的吸光度值成線性關係，B圖顯示SRB方法來測試miRNA對兩株肺癌細胞細胞系的增殖影響[2]。

比色法因為操作簡單快捷，成本相對便宜等優點十分適用於高通量的藥物篩選。然而，對於少量細胞或者單個細胞細胞增殖活性分析，比色法卻是不合適的，此時又該選擇什麼樣的方法呢？且往後看。。。

對於少量細胞或單個細胞增殖的檢測一般從以下方面著手：

二、DNA合成檢測

通過測定分裂的細胞DNA含量，直接反應細胞的增殖能力，以最常見的BrdU和EdU為例[1]。它們的基本原理相似，作為胸腺嘧啶的衍生物，可以參與到DNA複製中，代替正常的胸腺嘧啶（T），進而通過抗體或者熒游標記等方式檢測，進而反應DNA的含量。下面具體看一下這兩種方法上的不同及其特點。

1. BrdU插入

方法：基於BrdU特異性抗體檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力

實驗步驟：孵育細胞→加入BrdU工作液→甲醇/醋酸固定細胞及DNA變性→孵育加1抗即抗BrdU單抗（工作濃度1：50）→加HRP標記的二抗→顯色。

實驗步驟來源於abcam：BrdU CellProliferation ELISA Kit(colorimetric)）

數據分析：如下圖：通過ELISA方式檢測BrdU標記的細胞，發現ELISA OD值在一定範圍內有良好的線性關係；未加入BrdU不能檢測到信號；H2O2處理細胞後抑制增殖。

BrdU通過ELISA方式檢測

缺點：

• 由於抗體分子量大，難於摻入並被有效檢測，需要進行DNA變性；
• BrdU檢測需要孵育BrdU單抗和帶標記的二抗，時間長甚至過夜；
• BrdU會肌體造成不可逆損傷，使用時注意安全，避免吸入BrdU粉塵。

2. EdU插入

方法：通過EdU與Apollo熒光染料的共軛反應，使得染料標記到EdU插入的增殖中的細胞，進而快速檢測細胞DNA複製活性。

實驗步驟：孵育細胞→加入EdU→固定細胞→加染料→熒光檢測

數據分析：下圖利用熒光顯微鏡，對EdU標記的各個細胞（圖1）或不同的組織（圖2）均能識別，起到標記增殖中細胞DNA的作用。其中藍色代表細胞核（DPAI）。

上圖源於：Cell-Light? EdU熒光顯微鏡檢測試劑盒說明書

優點：與BrdU檢測方法相比，EdU：

• 更快速：只需2.5h，無需抗原抗體反應；
• 更靈敏：EdU染料只有BrdU抗體的1/500，在細胞內很容易擴散；
• 更準確：無需DNA變性，能在細胞和組織水平更準確地反映DNA複製活性。

三、細胞增殖相關抗原檢測

檢測增殖細胞特異性地表達某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA只存在於增殖細胞中，而非增殖細胞缺乏這些抗原，因此常作為細胞增殖的標誌。

實驗過程：即免疫組化過程，基於一抗二抗孵育原理，由於比較繁瑣，我們後期會單獨介紹。

數據分析：如下圖對癌組織進行的Ki67和PCNA染色，褐色代表Ki67和PCNA的表達，可見藥物處理後，Ki67和PCNA表達降低，即細胞增殖能力降低。

免疫組化檢測腫瘤組織Ki67的表達[2]

免疫組化檢測腫瘤組織PCNA的表達

四、ATP濃度檢測

原理：ATP是細胞能量的直接來源，死亡細胞或即將死亡的細胞幾乎不含ATP，在細胞溶解物或提取物中測得的ATP濃度與細胞數之間存在嚴格的線性關係。

方法：目前應用最廣的方法：基於螢火蟲熒光素酶催化熒光素氧化，消耗ATP。發光量與ATP含量呈很好的線性關係，反應如圖顯示：

實驗步驟：

1. 樣品測定的準備：按照說明書加入專用裂解液，冰上裂解後離心去上清；

2. 標準曲線測定的準備：ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成適當的濃度梯度；

3. ATP檢測工作液的配製：按照每個樣品或標準品需100μL的ATP檢測工作液的比例；

4. ATP濃度的測定：

1. 加100μL的ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內。室溫放置3-5min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，從而降低本底；
2. 在檢測孔或檢測管內加上10-100μL樣品或標準品，迅速用槍(微量移液器)混勻，至少間隔2s後，立即用 luminometer儀測定RLU值或CPM。如果樣品中ATP的濃度特別高，可以用MilliQ級的純水或重蒸水稀釋樣品後再測定；
3. 根據標準曲線計算出樣品中ATP的濃度；
4. 為了消除樣品製備時由於蛋白量的差異而造成的誤差，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度，然後把ATP的濃度換算成nmol/mg蛋白的形式。

5. 根據ATP與處理組方案如藥物濃度繪製曲線。

數據分析：如圖：HepG2細胞經不同濃度Tamoxifen處理後，經過ATP檢測試劑盒得到的熒光值與藥物擬合的曲線；要注意的是ATP檢測時，試劑孵育時間不能過長，否則會影響實驗準確性。

藥物處理後的HepG2細胞的ATP曲線[3]

那麼在這些方法中，我們究竟應該如何選擇呢？這主要取決於實驗目的和細胞類型以及數目。

• 若直接測細胞增殖：可用BrdU或EdU標記法，其中EdU更加快捷準確。
• 如研究細胞的代謝活性：那麼直接選擇比色法檢測，即MTS、CCK8及SRB法等；
• 若是高通量的藥物篩選：懸浮細胞推薦採用MTS，CCK-8這兩種方法，操作較為簡單；若是貼壁細胞推薦SRB法，不受時間限制，且有很好的線性關係。
• 但若藥物帶有顏色：藥物的高通量篩選，且藥物處理時間較短，帶有顏色，推薦採用基於ATP的檢測方法。
• 細胞類型：如果是懸浮細胞，不適合SRB和MTT，推薦使用MTS和CCK8法。
• 研究單個細胞：適合選擇BrdU或EdU標記法，不適合比色法。
• 研究少量細胞：如果細胞數少於500，則推薦使用基於ATP的檢測方法；
• 若對細胞增殖及代謝等多個方面感興趣：可以通過多種方法來驗證，如可以選擇用BrdU標記，再通過比色法、化學發光或熒光檢測進行分析。

常見問題匯總

MTS、CCK8及SRB法等方法，如何確定選擇哪個？

大家可根據實驗要求和預算進行選擇，價格方面，CCK8和MTS大於SRB，但是SRB操作較繁瑣，但個人覺得SRB線性更好，但不適用於懸浮細胞。

OD不在線性範圍內，怎麼辦？誤差大嗎？

如MTS要求0.8，（通常來說，比色法測定細胞增殖試劑盒中都會註明最佳反應時間，通常MTS/CCK8反應最佳時間為1h-4h，我們實驗初期固定孵育時間如1h，通過比較不同細胞量的OD值來確定實驗細胞鋪板量，根據具體情況進行調整。

對細胞密度有要求嗎？

不同類型的細胞，代謝活性不同，影響細胞代謝的因素也會影響細胞數和吸光值的關係。細胞在高細胞密度時會產生接觸抑制，進而代謝活性降低，導致細胞數和吸光度值的非線性關係。對大多數腫瘤細胞，雜瘤細胞和纖維母細胞系，推薦5000cells/孔作為增殖研究的起始細胞數，雖然少於1000個細胞通常也可被檢測。血淋巴細胞例外，一般需要25,000–250,000細胞/孔才能獲得足夠的吸光值。可以參考下圖的實驗來確定細胞數。

通過以上介紹，相信大家對細胞增殖的檢測方法有了比較系統的認識，在具體實驗中，只需要根據具體的實驗目的和細胞類型選擇最佳的實驗方案。

祝大家實驗順利~

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