第六章 微生物的代謝和發酵

第六章 微生物的代謝和發酵

　　新陳代謝（metabolism）簡稱代謝，是指發生在活細胞中的各種分解代謝（catabolism）和合成代謝（anabolism）的總和，即：

新陳代謝=分解代謝+合成代謝

　　分解代謝是指複雜的有機物分子通過分解代謝酶系的催化，產生簡單分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和還原力（或稱還原當量，一般用[H]來表示）的作用；合成代謝與分解代謝正好相反，是指在合成代謝酶系的催化下，由簡單小分子、ATP形式的能量和[H]形式的還原力一起合成複雜的大分子的過程。分解代謝與合成代謝的含義及其間的關係可簡單地表示為：

　　分解代謝與合成代謝間有著極其密切的聯繫，這些聯繫將放在第二節中討論。

　　一切生物，在其新陳代謝的本質上既存在著高度的統一性，同時，不同的生物間又存在著明顯的特殊性。有關統一性的問題主要在普通生物化學課程中討論，這裡由於篇幅和重點的關係，在簡要地概括微生物能量代謝及其在微生物生命活動中的功能外，將更多地討論有關微生物代謝的特殊性問題。

一、化能異養微生物的生物氧化和產能

　　生物氧化就是發生在活細胞內的一系列產能性氧化反應的總稱。生物氧化與非生物氧化即燃燒有著若干相同點和不同點，相同點是它們的總效應都是通過有機物的氧化反應而釋放出其中的化學潛能，不同點有很多，可見表6-1。

　　生物氧化的形式包括某物質與氧結合、脫氫或失去電子三種；生物氧化的過程可分脫氫（或電子）、遞氫（或電子）和受氫（或電子）三個階段；生物氧化的功能則有產能（ATP）、產還原力[H]和產小分子中間代謝物三種。以下我們按底物（基質）脫氫的三個階段以及各階段的類型和細節的順序來討論化能異養微生物的生物氧化及其產能效應。

　　（一）底物脫氫的四條主要途徑

　　這裡以葡萄糖作為典型的生物氧化底物，它的脫氫階段主要可通過四條途徑，每條途徑既有脫氫、產能的功能，又有產多種形式小分子中間代謝物以供合成反應作原料的功能。在討論中除著重討論它們的產能功能外，還附帶介紹它們的一些其他重要功能。底物脫氫的途徑及其與遞氫、受氫階段聯繫的概貌見圖6-1。

　　1．EMP途徑（Embdem-Meyerhof-ParnasPathway）

　　EMP途徑又稱糖酵解途徑（glycolysis）或己糖二磷酸途徑（hexosediphosphatepathway）。它是以1分子葡萄糖為底物，約經過10步反應而產生2分子丙酮酸和2分子ATP的過程。在其總反應中，可概括成兩個階段（耗能和產能）、三種產物（NADH＋H⁺*、丙酮酸和ATP）和10個反應步驟。EMP途徑的簡式可見圖6-2。

　　在圖6-2的產物中，2NADH＋H⁺在有氧條件下可經呼吸鏈的氧化磷酸化反應產生6ATP，在無氧條件下，則可還原丙酮酸產生乳酸或還原丙酮酸的脫羧產物——乙醛而產生乙醇。

　　EMP途徑的總反應式為：

　　C₆H₁₂O₆＋2NAD⁺＋2ADP＋2Pi→2CH₃COCOOH＋2NADH＋2H⁺＋2ATP＋2H₂O有關EMP途徑的反應細節見圖6-3。

　　EMP途徑是絕大多數生物所共有的基本代謝途徑，因而也是酵母菌、真菌和多數細菌所具有的代謝途徑。在有氧條件下，EMP途徑與TCA途徑連接，並通過後者把丙酮酸徹底氧化成CO₂和H₂₀。在無氧條件下，丙酮酸或其進一步代謝後所產生的乙醛等產物被還原，從而形成乳酸或乙醇等發酵產物。EMP途徑的反應過程分10步，即：

　　（1）葡萄糖形成葡糖-6-磷酸。不同菌種通過不同方式實現這步反應。在酵母菌、真菌和許多假單胞菌等好氧細菌中，通過需要Mg²⁺和ATP的己糖激酶來實現（此反應在細胞內為不可逆反應）；在大腸桿菌和鏈球菌等兼性厭氧菌中，可借磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸轉移酶系統（見第五章第三節）在葡萄糖進入細胞之時即完成了磷酸化。

　　（2）葡糖-6-磷酸經磷酸己糖異構酶異構成果糖-6-磷酸。

　　（3）果糖-6-磷酸通過磷酸果糖激酶催化成果糖-1，6-二磷酸。磷酸果糖激酶是EMP途徑中的一個關鍵酶，故它的存在就意味著該微生物具有EMP途徑。與己糖激酶相似的是，磷酸果糖激酶也需要ATP和Mg²⁺，且在活細胞內催化的反應是不可逆的。

　　（4）果糖-1，6-二磷酸在果糖二磷酸醛縮酶的催化下，分裂成二羥丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸兩個丙糖磷酸分子。果糖二磷酸醛縮酶不但在葡萄糖降解中十分重要，而且對葡糖異生作用（gluconeogenesis）即對由非碳水化合物前體逆向合成己糖的反應也很重要。另外，二羥丙酮磷酸在糖代謝和脂類代謝中還是一個重要的連接點，因為它可被還原成甘油磷酸而用於脂類的合成中。

　　（5）二羥丙酮磷酸在丙糖磷酸異構酶的作用下轉化成甘油醛-3-磷酸。雖然在反應（4）中產生等分子的丙糖磷酸，但二羥丙酮磷酸只有轉化為甘油醛-3-磷酸後才能進一步代謝下去。因此，己糖分子至此實際上已生成了2分子甘油醛-3-磷酸。此後的代謝反應在所有能代謝葡萄糖的微生物中都沒有什麼不同了。

　　（6）甘油醛-3-磷酸在甘油醛-3-磷酸脫氫酶的催化下產生1，3-二磷酸甘油酸。此反應中的酶是一種依賴NAD⁺的含硫醇酶，它能把無機磷酸結合到反應產物上。這一氧化反應由於產生一個高能磷酸化合物和一個NADH＋H⁺，所以從產能和產還原力的角度來看都是十分重要的。

　　（7）1，3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶的催化下形成3-磷酸甘油酸。此酶是一種依賴Mg²⁺的酶，它催化1，3-二磷酸甘油酸C-1位置上的高能磷酸基轉移到ADP分子上，產生了本途徑中的第一個ATP。這是借底物水平磷酸化作用而產ATP的一個實例。

　　（8）3-磷酸甘油酸在磷酸甘油酸變位酶的作用下轉變為2-磷酸甘油酸。

　　（9）2-磷酸甘油酸在烯醇酶作用下經脫水反應而產生含有一個高能磷酸鍵的磷酸烯醇式丙酮酸。烯醇酶需要Mg²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺等二價金屬離子作為激活劑。

　　（10）磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下產生了丙酮酸，這時，磷酸烯醇式丙酮酸分子上的磷酸基團轉移到ADP上，產生了本途徑的第二個ATP，這是借底物水平磷酸化而產生ATP的又一個例子。

　　由上可知在無氧條件下，整個EMP途徑的產能效率是很低的，即每一個葡萄糖分子僅凈產2個ATP，但其中產生的多種中間代謝物不僅可為合成反應提供原材料，而且起著連接許多有關代謝途徑的作用。從微生物發酵生產的角度來看，EMP途徑與乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇和丁二醇等大量重要發酵產物的生產有著密切的關係（詳見本節「發酵」內容）。

　　2．HMP途徑（hexosemonophosphatepathway）HMP途徑即已糖一磷酸途徑，有時也稱戊糖磷酸途徑、Warburg-Dickens途徑或磷酸葡萄糖酸途徑。這是一條葡萄糖不經EMP途徑和TCA途徑而得到徹底氧化，並能產生大量NADPH＋H⁺*形式的還原力和多種重要中間代謝物的代謝途徑。HMP途徑的總反應可用一簡圖表示（圖6-4）。

　　HMP途徑可概括成三個階段：①葡萄糖分子通過幾步氧化反應產生核酮糖-5-磷酸和CO₂；②核酮糖-5-磷酸發生同分異構化（isomerization）或表異構化（epimerization）而分別產生核糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸；③上述各種戊糖磷酸在沒有氧參與的條件下發生碳架重排，產生了己糖磷酸和丙糖磷酸，然後丙糖磷酸可通過以下兩種方式進一步代謝：其一為通過EMP途徑轉化成丙酮酸再進入TCA循環進行徹底氧化，另一為通過果糖二磷酸醛縮酶和果糖二磷酸酶的作用而轉化為己糖磷酸。以上三個階段的細節見圖6-5。

　　在圖6-5的反應（1）和（2）中，產生的戊糖磷酸與還原力（NADPH＋H⁺）的比率為1∶2，即：

　　3葡萄糖-6-磷酸＋6NADP⁺＋3H₂O→3戊糖-5-磷酸＋3CO₂＋6NADPH＋6H⁺在圖6-5的反應（3）中，其凈效應為：

2木酮糖-5-磷酸＋核糖-5-磷酸

2果糖-6-磷酸＋甘油醛-3-磷酸

　　在一定條件下，上述反應中產生的甘油醛-3-磷酸也可通過生成葡萄糖的反應重新合成葡糖-6-磷酸，因此，HMP途徑要進行一次周轉就需要6個葡糖-6-磷酸分子同時參與（詳細過程見圖6-6），其總式為：

　　6葡糖-6-磷酸＋12NADP⁺＋6H₂O—→5葡糖-6-磷酸＋12NADPH＋12H⁺＋12CO₂＋Pi

　　HMP途徑在微生物生命活動中有著極其重要的意義，具體表現在：

　　（1）為核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸。

　　（2）產生大量的NADPH₂形式的還原劑，它不僅為合成脂肪酸、固醇等重要細胞物質之需，而且可通過呼吸鏈產生大量能量，這些都是EMP途徑和TCA循環所無法完成的。因此，凡存在HMP途徑的微生物，當它們處在有氧條件下時，就不必再依賴於TCA循環以獲得產能所需的NADH₂了。

　　（3）如果微生物對戊糖的需要超過HMP途徑的正常供應量時，可通過EMP途徑與本途徑在果糖-1，6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸處的連接來加以調劑。

　　（4）反應中的赤蘚糖-4-磷酸可用於合成芳香氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸。

　　（5）由於在反應中存在著C₃～C7的各種糖，使具有HMP途徑的微生物的碳源利用範圍更廣，例如它們可以利用戊糖作碳源。

　　（6）通過本途徑而產生的重要發酵產物很多，例如核苷酸、若干氨基酸、輔酶和乳酸（異型乳酸發酵）等。

　　據研究，當以硝酸鹽作為麴黴屬一些菌種的氮源時，有關HMP途徑酶的濃度要比長在其他氮源上時增高許多，這與硝酸鹽還原酶催化時需要大量NADPH₂是一致的。又如，用放射呼吸測定技術（radiorespirometry）研究大腸桿菌對碳源（葡萄糖）的利用時，發現其中約有28％是進入HMP途徑而氧化的，其餘的72％則是通過EMP途徑氧化的。

　　3．ED途徑（Entner-Doudoroffpathway） ED途徑又稱2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途徑。此途徑最早（1952）由Entner和Doudoroff兩人在Pseudomonassaccharophila（嗜糖假單胞菌）中發現，接著許多學者證明它在細菌中廣泛存在。ED途徑是少數缺乏完整EMP途徑的微生物所具有的一種替代途徑，在其他生物中還沒有發現。其特點是葡萄糖只經過4步反應即可快速獲得由EMP途徑須經10步才能獲得的丙酮酸。ED途徑的總反應概貌和細節可見圖6-7和6-8。

　　在ED途徑中的關鍵反應是2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解，其具體步驟見圖6-9。

　　ED途徑是少數EMP途徑不完整的細菌例如Pseudomonasspp．（一些假單胞菌）和ZymomonassPP．（一些發酵單胞菌）等所特有的利用葡萄糖的替代途徑，其特點是利用葡萄糖的反應步驟簡單，產能效率低（1分子葡萄糖僅產1分子ATP，僅為EMP途徑之半），反應中有一個6碳的關鍵中間代謝物——KDPG。由於ED途徑可與EMP途徑、HMP途徑和TCA循環等各種代謝途徑相連接，因此可以相互協調，以滿足微生物對能量、還原力和不同中間代謝物的需要，例如，通過與HMP途徑連接可獲得必要的戊糖和NADPH₂等。此外，在ED途徑中所產生的丙酮酸對Zymomonasmobilis（運動發酵單胞菌）這類微好氧菌來說，可脫羧成乙醛，乙醛進一步被NADH₂還原為乙醇。這種經ED途徑發酵產生乙醇的過程與傳統的由酵母菌通過EMP途徑生產乙醇不同，因此稱作細菌酒精發酵。

　　利用Z.mobilis等細菌以生產酒精，是近年來正在開發的工業，它比傳統的酵母酒精發酵有許多優點：（1）代謝速率高，（2）產物轉化率高，（3）菌體生成少，（4）代謝副產物少，（5）發酵溫度較高，以及（6）不必定期供氧等。當然，細菌酒精發酵也有其缺點，主要是其生長PH為5，較易染菌（而酵母菌為pH3），其次是細菌耐乙醇力較酵母菌為低（前者約為7.0％，後者則為8～10％）。

　　在不同的微生物中，EMP、HMP和ED三途徑在己糖分解代謝中的重要性是有明顯差別的，有關實例可見表6-2。

　　4．三羧酸循環（tricarboxylicacidcycle） 三羧酸循環又稱TCA循環、Krebs循環或檸檬酸循環。這是一種循環方式的反應順序，它在絕大多數異養微生物的氧化性（呼吸）代謝中起著關鍵性的作用。在真核微生物中，TCA循環的反應在線粒體內進行，其中的大多數酶定位在線粒體的基質中；在原核生物例如細菌中，大多數酶都存在於細胞質內。只有琥珀酸脫氫酶屬於例外，它在線粒體或細菌中都是結合在膜上的。

　　三羧酸循環的主要反應產物見圖6-10。

　　從產能的角度來看，如果把丙酮酸進入循環前的「入門反應」（gatewaystep）所產生的NADH+H⁺也計入的話，則每個丙酮酸分子的徹底氧化可高效地產生15個ATP。有關三羧酸循環的反應細節見圖6-11。

　　從TCA循環在微生物物質代謝中的地位來看，它在一切分解代謝和合成代謝中都佔有樞紐的地位，因而也與微生物大量發酵產物例如檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸和谷氨酸等的生產密切相關（圖6-12）。

　　檸檬酸是葡萄糖經TCA循環而形成的最有代表性的發酵產物，在工業發酵中應用的菌種一般為Aspergillusniger（黑麴黴），檸檬酸的產生機制見圖6-13。從理論上來計算，1分子葡萄糖只能產生2/3分子的檸檬酸，即相當於每100g葡萄糖產生71.1g檸檬酸，可是，生產實踐上卻常可獲得75～87g檸檬酸。用同位素14CO₂作實驗後證明，在檸檬酸合成過程中，還伴隨著大量的CO₂固定，這就解釋了上面提到的現象。

　　以上已經介紹了以葡萄糖為代表的生物氧化底物的四條主要脫氫途徑，並簡要地介紹了它們在產能、產還原力、分解或合成代謝以及生產發酵產物中的重要作用，有關它們在產能效率方面的簡單比較可見表6-3。

　　（二）遞氫和受氫

　　在生物體中，貯存在葡萄糖等有機物中的化學能，經上述的多種途徑脫氫後，經過呼吸鏈（或稱電子傳遞鏈）等方式進行遞氫，最終與受氫體（氧、無機或有機氧化物）結合，以釋放其化學潛能。根據遞氫特別是受氫過程中氫受體性質的不同，可以把生物氧化區分成呼吸（有氧呼吸）、無氧呼吸和發酵三種類型（圖6-14）。

　　1．呼吸（respiration） 呼吸是一種最普遍和最重要的生物氧化方式，其特點是底物按常規方式脫氫後，經完整的呼吸鏈[RC，respiratorychain，又稱電子傳遞鏈（ETC，electrontransportchain）]遞氫，最終由分子氧接受氫併產生水和釋放能量（ATP）。由於呼吸必須在有氧條件下進行，因此又稱有氧呼吸（aerobicrespiration）。呼吸鏈是指位於原核生物細胞膜上或真核生物線粒體膜上的由一系列氧化還原勢不同的氫傳遞經（或電子傳遞體）組成的一組鏈狀傳遞順序，它能把氫或電子從低氧化還原勢的化合物處傳遞給高氧化還原勢的分子氧或其他無機、有機氧化物，並使它們還原。在氫或電子的傳遞過程中，通過與氧化磷酸化反應發生偶聯，就可產生ATP形式的能量。

　　組成呼吸鏈的氫或電子的載體，除醌類外，都是一些含有輔酶或輔基的酶，正是依靠這些輔酶或輔基才能實現它們在呼吸鏈中所執行的氧化還原功能。每種輔酶或輔基在氧化與還原條件下，都有其特定的吸收光譜值，因此可通過分光光度計來確定呼吸鏈的組分及其所處的狀態。在微生物中最重要的呼吸鏈的組分，有以下幾種：

　　（1）煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）*某些脫氫酶含有NAD⁺或NADP⁺形式的輔酶，能從還原性底物上移出1個氫離子（質子）和2個電子，而變成還原態的NAD（P）H+H⁺。它們的結構和引起的氧化還原反應見圖6-15。

　　（2）黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黃素單核苷酸（FMN） FAD和FMN是一類稱為黃素蛋白（FP，flavoprotein）的脫氫酶的輔基，它們的活性基團是異咯嗪結構，其基本結構和遞氫功能見圖6-16。

　　（3）鐵硫蛋白（Fe-S） 是傳遞電子的氧化還原載體，這類小分子蛋白的輔基是其分子中含鐵硫（有些為「2Fe+2S」，另一些為「4Fe+4S」）的中心部分。鐵硫蛋白存在於呼吸鏈的幾種酶複合體中，參與膜上的電子傳遞。此外，在固氮、亞硫酸還原、亞硝酸還原、光合作用、分子氫的激活和釋放以及鏈烷的氧化中也有作用。在呼吸鏈中的「2Fe+2S」中心（圖6-17）每次僅能傳遞一個電子。

　　（4）泛醌（輔酶Q） 是一類脂溶性的氫載體。泛醌廣泛存在於真核生物線粒體內膜和革蘭氏陰性細菌的細胞膜上；而革蘭氏陽性細菌和某些革蘭氏陰性細菌則含甲基萘醌（MK或維生素K₂）。醌類在呼吸鏈中的功能是傳遞氫，傳遞過程分兩步進行，中間體是半醌。在呼吸鏈中，醌類的含量比其他組分多10～15倍，其作用是收集來自呼吸鏈各種輔酶和輔基所輸出的氫（還原力[H]）的作用，然後再將它們傳遞給細胞色素系統。泛醌的結構和功能見圖6-18。

　　（5）細胞色素系統 細胞色素系統位於呼吸鏈的後端，它們的功能是傳遞電子而不是傳遞氫。它們只從泛醌中接受電子，同時將同等數目的質子推到線粒體膜（真核生物）或細胞膜（原核生物）外的溶液中。細胞色素按其吸收光譜和氧還電位的差別可分成多種類型，如cyt.a，cyt.a₃，cyt.b，cyt.c和cyt.o等。它們都有血紅素作為輔基，而血紅素則通過其分子中心鐵原子的價電荷的變化而傳遞電子。細胞色素a₃即細胞色素氧化酶，它是許多微生物的末端氧化酶，能催化4個電子還原氧的反應，

O₂+4Fe²⁺→2O^2-+4F³⁺

　　從而把氧分子激活。有關細胞色素在傳遞電子中的作用見圖6-19。

　　不論在真核生物或原核生物中，呼吸鏈的主要組分都是類似的，一般為：NAD（P）→FP→Fe·S→CoQ→Cyt.b→Cyt.c→Cyt.a→Cyt.a₃（圖6-20）。然而，在原核生物中，各具體組分卻有很大的變化。這種變化除了表現在不同種間外，在同一個種生活在不同的環境條件（例如生長期、碳源、末端電子受體等）下時也會發生明顯的變化。在原核生物中，只有少數種如Paracoccusdenitrificans（脫氮副球菌）和Alcaligeneseutrophus（真養產鹼菌）的呼吸鏈與真核生物的呼吸鏈相似，因而John和Whalley（1975）就提出了一個關於線粒體起源的內共生學說。這一學說認為，由於早期的P．denitrificans與其宿主細胞共生，而使前者成為後者細胞內的線粒體。

　　與真核生物線粒體膜上的呼吸鏈相比，原核生物細胞膜上的呼吸鏈有幾個主要差別（表6-4），尤其是：（1）氧還載體的取代性強：如CoQ可被MK（甲基萘醌）或DMK（脫甲基甲基萘醌）所取代，Cyt.a₃可被Cyt.aa₃、Cyt.o或Cyt.d所取代等；（2）氧還載體的數量可增可減，如E.coli的細胞色素就有9種以上；（3）有分支呼吸鏈的存在：除了前面已提及的來自不同底物的還原力[H]進入呼吸鏈的前端時有不同的分支外，主要是呼吸鏈後端細胞色素系統中的分支類型多。例如，E.coli在缺氧條件下，在CoQ後的呼吸鏈就分成兩支，一支是Cyt.b₅₅₆→Cyt.o，另一支是Cyt.b₅₅₈→Cyt.d（這一支可抗氰化物抑制）；又如，在Azotobactervinelandii（維涅蘭德固氮菌）的Cyt.b後，呼吸鏈可分出4條分支，等等。

　　呼吸鏈在傳遞氫或電子的過程中，通過與氧化磷酸化作用的偶聯，產生了生物的通用能源——ATP。其中包括的機制，目前仍在繼續研究中。至今能獲得多數學者接受的是1978年諾貝爾獎獲得者英國學者P．Mitchell在1961年所提出的化學滲透學說（chemiosmotichypothesis）。該學說認為，在氧化磷酸化過程中，通過呼吸鏈酶系的作用，將底物分子上的質子從膜的內側傳遞至外側，從而造成了質子在膜的兩側分布的不均衡，亦即形成了質子梯度差（△μH⁺，或稱質子動勢、pH梯度等）。這個梯度差就是產生ATP能量的來源，因為它可通過ATP酶的逆反應，把質子從膜的外側再輸回到內側，結果，一方面消除了質子梯度差，同時就合成了ATP。化學滲透學說的模式表示可見圖6-21。

　　從圖6-20中可以看出，在典型的呼吸鏈中，只有三處能提供合成ATP所需的足夠能量。因此，在2[H]從NADH₂傳遞至O₂的過程中，只有三處能與磷酸化反應（ADP+Pi→ATP）相偶聯，亦即只有3分子磷酸能參與有機磷化物ATP的合成。這種關係用數量來表示的話就稱P/O比（即molATP/mol氧原子）。P/O比的高低表示呼吸鏈氧化磷酸化效率的高低。例如，以異檸檬酸或蘋果酸為底物時，動物的線粒體能由2[H]產生3ATP，即P/O=3；而以琥珀酸為底物時，由於琥珀酸脫氫酶的輔基是黃素蛋白，因此只能從FP水平進入呼吸鏈，故由2[H]只能獲得2個ATP，其P/O=2。

　　按化學滲透學說來看，生物的「通用能源」ATP是由跨膜的質子梯度差△μH⁺而產生的。因此，我們可以把質子梯度差理解成一個高水位的水源，ATP酶猶如一台水輪發電機，ATP則是由該發電機產生的電流。現把質子梯度差與ATP的相互關係及其在生命活動中的作用綜合在圖6-22中。

　　2．無氧呼吸（anaerobicrespiration） 無氧呼吸又稱厭氧呼吸，是一類呼吸鏈末端的氫受體為外源無機氧化物（個別為有機氧化物）的生物氧化。這是一類在無氧條件下進行的產能效率較低的特殊呼吸。其特點是底物按常規途徑脫氫後，經部分呼吸鏈遞氫，最終由氧化態的無機物（個別是有機物延胡索酸）受氫。

　　根據呼吸鏈末端的最終氫受體的不同，可把無氧呼吸分成以下多種類型。

　　（1）硝酸鹽呼吸（nitraterespiration） 又稱反硝化作用（denitrification）。硝酸鹽在微生物生命活動中具有兩種功能，其一是在有氧或無氧條件下所進行的同化性硝酸鹽還原作用，亦即微生物利用硝酸鹽作為其氮源營養物的作用；其二是在無氧條件下，微生物利用硝酸鹽作為呼吸鏈的最終氫受體，這是一種異化性的硝酸鹽還原作用，又稱硝酸鹽呼吸或反硝化作用。上述兩個還原過程的共同特點是硝酸鹽都要經過一種含鉬的硝酸鹽還原酶將其還原為亞硝酸。

　　能進行硝酸鹽呼吸的都是一些兼性厭氧微生物即反硝化細菌，而專性厭氧微生物是無法進行硝酸鹽呼吸的。反硝化細菌都有其完整的呼吸系統。只有在無氧條件下，才能誘導出反硝化作用所需要的硝酸鹽還原酶A（結合在膜上）和亞硝酸還原酶。能進行硝酸鹽呼吸的細菌種類很多，例如Bacilluslicheniformis（地衣芽孢桿菌），Paracoccusdenitrificans[脫氮副球菌，以前稱Micrococcusdenitrificans（脫氮小球菌）]，Pseudomonasaeruginosa（銅綠假單胞菌），Ps．stutzeri（斯氏假單胞菌）以及Thiobacillusdenitrificans（脫氮硫桿菌）等。

　　（2）硫酸鹽呼吸（sulfaterespiration） 是一種由硫酸鹽還原細菌（或稱反硫化細菌）把經呼吸鏈傳遞的氫交給硫酸鹽這類末端氫受體的一種厭氧呼吸。這是一種異化性的硫酸鹽還原作用。通過這一過程，微生物就可在無氧條件下借呼吸鏈的電子傳遞磷酸化而獲得能量。

　　硫酸鹽還原的最終產物是H₂S，自然界中的大多數H₂S是由這一反應產生的。

　　與硝酸鹽還原細菌不同的是，硫酸鹽還原細菌都是一些嚴格依賴於無氧環境的專性厭氧細菌，例如Desulfovibriodesulfuricans（脫硫脫硫弧菌），D．gigas（巨大脫硫弧菌），Desulfotomaculumnigrificans（致黑脫硫腸狀菌）以及D．ruminis（瘤胃脫硫腸狀菌）等。

　　（3）硫呼吸（sulphurrespiration） 這是近年來才發現的一種無氧呼吸類型。目前只知道Desulfuromonasacetoxidans（氧化乙酸脫硫單胞菌）能進行硫呼吸。其過程為，無機硫作為無氧呼吸鏈的最終氫受體，結果硫被還原成H₂S。

　　（4）碳酸鹽呼吸（carbonaterespiration） 是一類以CO₂或重碳酸鹽作為無氧呼吸鏈的末端氫受體的無氧呼吸。根據其還原產物的不同，可分為兩種類型，一類是產甲烷菌產生甲烷的碳酸鹽呼吸，另一類為產乙酸細菌產生乙酸的碳酸鹽呼吸。有關它們的詳細內容將在第九章第五節中討論。

　　（5）延胡索酸呼吸（fumaraterespiration） 以往都是把琥珀酸的形成作為微生物的一般發酵產物來考慮的，可是，在延胡索酸呼吸中，延胡索酸卻被充作無氧呼吸鏈的末端氫受體，而琥珀酸則是延胡索酸的還原產物。

　　許多兼性厭氧細菌，例如Escherichia（埃希氏桿菌屬）、Proteus（變形桿菌屬）、Salmonella（沙門氏菌屬）和Klebsiella（克氏桿菌屬）等腸桿菌，以及厭氧細菌例如Bacteroides（擬桿菌屬）、Propionibacterium（丙酸桿菌屬）和Vibriosuccinogenes（產琥珀酸弧菌）等，都能進行延胡索酸呼吸。在無氧條件下培養它們時，如在培養基中加入延胡索酸，就會促使其快速生長並有較高的細胞得率，其原因是它們可利用延胡索酸作為末端氫受體，從而可利用電子傳遞磷酸化產生大量的ATP。

　　3．發酵（fermentation） 「發酵」這一名詞用得十分普遍。在發酵工業上，發酵是指任何利用好氧或厭氧微生物來生產有用代謝產物的一類生產方式；而在生物氧化或能量代謝中，發酵僅是指在無氧條件下，底物脫氫後所產生的還原力[H]不經過呼吸鏈傳遞而直接交給某一內源氧化性中間代謝產物的一類低效產能反應，即：

　　發酵的類型很多，以下擬從與EMP、HMP、ED途徑有關的幾類發酵和稱作Stickland反應的獨特氨基酸發酵這四個方面來加以討論。

　　（1）由EMP途徑中丙酮酸出發的發酵 丙酮酸是EMP途徑的關鍵產物，由它出發，在不同的微生物中可進行多種發酵，例如，由Saccharomycescerevisiae（釀酒酵母）進行的酵母型酒精發酵；由Lactobacillusdelbruckii（德氏乳桿菌）等進行的同型乳酸發酵；由Propionibacteriumshermanii（謝氏丙酸桿菌）進行的丙酸發酵；由Enterobacteraerogenes（產氣腸桿菌）等進行的2，3-丁二醇發酵；由E．coli等進行的混合酸發酵；以及由各種厭氧梭菌例如Clostridiumbutyricum（丁酸梭菌）、Cl．butylicum（丁醇梭菌）和Cl.acetobutylicum（丙酮丁醇梭菌）等所進行的丁酸型發酵等。通過這些發酵，微生物可獲得其生命活動所需的能量，而對人類的生產實踐來說，就可以通過工業發酵手段大規模地生產這類代謝產物。此外，某些特殊代謝產物還是鑒定菌種時的重要生化指標。例如，V．P．試驗（Vogos-Prouskauertest）就是利用Enterobacteraerogenes能產生3-羥基丁酮（乙醯甲基甲醇）的原理來設計的。

　　現把從丙酮酸出發的6條發酵途徑及其相互聯繫總結在圖6-23中。

　　在以上的6條發酵途徑中，Clostridiumacetobutyricum所進行的丙酮丁醇發酵，是迄今為止由嚴格厭氧菌所進行的唯一能大規模生產的發酵產品。該菌在利用玉米粉等澱粉原料發酵後，產生的是混合溶劑，其中的丙酮：丁醇：乙醇大體上為3：6：1（重量比）。其具體代謝途徑見圖6-24。

　　（2）通過HMP途徑的發酵——異型乳酸發酵（heterolacticfermentation）凡葡萄糖發酵後產生乳酸、乙醇（或乙酸）和CO₂等多種產物的發酵稱異型乳酸發酵；相對的如只產生2分子乳酸的發酵，則稱同型乳酸發酵（homolacticfermentation）。

　　一些異型發酵乳酸桿菌例如Leuconostocmesenteroides（腸膜明串珠菌）、L．cremoris（乳脂明串珠菌）、Lactobacillusbrevis（短乳桿菌）、L．fermentum（發酵乳桿菌）和Bifidobacteriumbifidum（兩歧雙歧桿菌）等，因缺乏EMP途徑中的若干重要酶——醛縮酶和異構酶，因此其葡萄糖的降解完全依賴HMP途徑。不同的微生物雖然都進行異型乳酸發酵，但其發酵途徑和產物仍稍有不同。例如，Leuconostocmesenteroides的葡萄糖發酵產物為乳酸、乙醇和CO₂，核糖的發酵產物為乳酸和乙酸，果糖的發酵產物為乳酸、乙酸、CO₂和甘露醇（3果糖→乳酸+乙酸+CO2+2甘露醇）；又如，Bifidobacteriumbifidum可把葡萄糖發酵為乳酸和乙酸（2葡萄糖→2乳酸+3乙酸）。

　　當Leuconostocmesenteroids以葡萄糖為發酵底物時，所進行的總反應是：

　　而當其以核糖作發酵底物時，所進行的總反應則是：

　　現把L.mesenteroides利用葡萄糖和核糖作底物而進行的異型乳酸發酵總反應畫在圖6-25中。

　　在異型乳酸發酵過程中，由木酮糖-5-磷酸經磷酸轉酮酶（phosphoketolase）產生乙醯磷酸和甘油醛-3-磷酸，然後分別產生乙酸和乙醇。其反應見圖6-26。

　　現將異型乳酸發酵與同型乳酸發酵間的主要差別列在表6-5中。

　　（3）通過ED途徑進行的發酵 通過ED途徑的發酵就是指細菌的酒精發酵（詳見ED途徑）。至此，我們已討論過的酒精發酵已有三個類型，即通過EMP途徑的酵母酒精發酵、通過HMP途徑（異型乳酸發酵）的細菌酒精發酵和通過ED途徑的細菌酒精發酵。

　　與乳酸發酵相類似，因為葡萄糖通過EMP與ED途徑都可產生2個乙醇分子，我們也可稱其為「同型酒精發酵」（homoalcholicfermentation），而通過HMP途徑的酒精發酵因1個葡萄糖分子會產生1分子乙醇和1分子乳酸，故我們也可稱其為「異型酒精發酵」（heteroalcoholicfermentation）。現將它們的反應式分別列在下面。

　　①酵母的「同型酒精發酵」：由Saccharomycescerevisiae（釀酒酵母）等通過EMP途徑進行。

葡萄糖+2ADP+2Pi→2乙醇+2CO₂+2ATP

　　②細菌的「同型酒精發酵」：由Zymomonasmobilis（運動發酵單胞菌）等通過ED途徑進行。

葡萄糖+ADP+Pi→2乙醇+2CO₂+ATP

　　③細菌的「異型酒精發酵」：由Leuconostocmesenteroides等通過HMP途徑進行。

葡萄糖+ADP+Pi→乳酸+乙醇+CO₂+ATP

　　此外，由於這三類酒精發酵所經過的途徑是不同的，所以在發酵產物——乙醇分子上的碳原子來源也是不同的。如果將葡萄糖分子的不同碳原子進行14C標記，並測定14C在產物中的分布，則上述三條途徑的差別可從圖6-27中看到。

　　（4）氨基酸發酵產能——Stickland反應 34年，L．H．Stickland發現少數厭氧梭菌例如Clostridiumsporogenes（生孢梭菌）能利用一些氨基酸同時當作碳源、氮源和能源，經深入研究後，發現其產能機制是通過部分氨基酸（如丙氨酸等）的氧化與另一些氨基酸（如甘氨酸等）的還原相偶聯的發酵方式。這種以一種氨基酸作氫供體和以另一種氨基酸作氫受體而產能的獨特發酵類型，稱為Stickland反應。Stickland反應的產能效率很低，每分子氨基酸僅產1個ATP。

　　在Stickland反應中，作為氫供體的氨基酸主要有丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、組氨酸和色氨酸等，作為氫受體的氨基酸主要有甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、鳥氨酸、精氨酸和色氨酸等。現以丙氨酸和甘氨酸間的發酵反應為例（圖6-28），來說明這種反應的生化機制。它們的總反應是：

　　除Clostridiumsporogenes外，還發現C.botulinum（肉毒梭菌）和C.sticklandii（斯氏梭菌）等也能進行Stickland反應。

　　（5）發酵中的產能反應 僅是專性厭氧菌或兼性厭氧菌在無氧條件下的一種生物氧化形式，其產能方式只是通過底物水平的磷酸化，因而產能效率很低。

　　底物水平磷酸化可形成多種含高能磷酸的產物，例如EMP途徑中的1，3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸及異型乳酸發酵途徑中的乙醯磷酸等。因前兩者在生物化學課程中有詳細的介紹，故這裡僅介紹乙醯磷酸的形成及其產生ATP的反應。在不同厭氧菌的發酵過程中，有不同的方式形成乙醯磷酸，例如：

　　①在Lactobacillusdelbriuckii中由丙酮酸產生：

　　②許多原核厭氧微生物中由乙醯輔酶A產生：

　　③在Leuconostocmesenteroides中Bifidobacteriumbifidum中由木酮糖磷酸產生：

　　④在Bifidobacteriumbifidumk中還可由果糖磷酸產生：

　　有了乙醯磷酸後，只要經乙酸激酶的催化，就可完成底物水平磷酸化產能：

CH₃CO-OPO₃H₂+ADP

CH₃COOH+ATP

　　這就是厭氧微生物產能的主要方式，並由此可知道它們的產能效率是很低的。

二、自養微生物的生物氧化、產能和CO₂　固定

　　異養微生物和自養微生物在最初能源上儘管存在著巨大的差異，但它們生物氧化的本質卻是相同的，即都包括脫氫、遞氫和受氫三個階段，其間經過與磷酸化反應相偶聯，就可產生生命活動所需的通用能源——ATP。但從具體類型來看，自養微生物中的生物氧化與產能的類型很多、途徑複雜，有些化能自養菌的生物氧化與產能過程至今還了解很少。不論是化能無機營養型還是光能無機營養型的微生物，在它們生命活動中最重要的反應就是把CO₂　先還原成[CH₂　O]水平的簡單有機物，然後再進一步合成複雜的細胞成分。這是一個大量耗能和耗還原力[H]的過程。在化能無機營養型微生物中，其所需能量ATP是通過還原態無機物經過生物氧化產生的，還原力[H]則是通過耗ATP的無機氫（H⁺　+e）的逆呼吸鏈傳遞而產生的；在光能自養型的微生物中，其ATP和[H]都是通過循環光合磷酸化、非循環光合磷酸化或通過紫膜的光合磷酸化而獲得的（圖6-29）。

　　（一）生物氧化和產能

　　1．化能自養型化能自養菌為還原CO₂　而需要的ATP和還原力[H]是通過氧化無機底物（NH⁴⁺、NO^2-　、H₂　S、S₀　、H₂　和Fe²⁺　等）來實現的。其產能的途徑主要也是藉助於經過呼吸鏈的氧化磷酸化反應，因此，絕大多數化能自養菌是好氧菌。即使少數可進行厭氧生活的化能自養菌，也是利用以硝酸鹽或碳酸鹽代替氧的無氧呼吸。除呼吸鏈產能途徑外，少數硫桿菌例如Thiobacillusthioparus（排硫硫桿菌）、T．denitrificans（脫氮硫桿菌）和T．ferrooxidans（氧化亞鐵硫桿菌）當其生長在含無機硫化物環境下，還能部分地進行底物水平磷酸化產能。必須指出的是，化能自養微生物不僅在還原CO₂　時需要消耗ATP，而且當其生產還原力[H]時，也要消耗許多ATP（圖6-30）。這是因為，只有借輸入ATP才能通過逆呼吸鏈的方式把無機氫（H⁺　+e）變成可用於還原CO₂　的還原力[H]。這一情況，可以用抽水機把低水位的水重新回灌到高水位蓄水庫去的例子來加以理解。

　　在所有還原態的無機物中，除了H₂　的氧化還原電位比NAD⁺　／NADH對較低外，其餘都明顯高於它，因此，在各種無機底物氧化時，都必須以其相應的位置進入呼吸鏈（圖6-31），這就必然造成化能自養菌呼吸鏈的氧化磷酸化效率（P／O比）很低。

　　由於化能自養細菌的產能效率、生長速率和生長得率很低等原因，故對它們的生物氧化和能量代謝還研究得很少。與異養微生物相比，化能自養細菌的能量代謝主要有三個特點：①無機底物的氧化直接與呼吸鏈發生聯繫。由脫氫酶或氧化還原酶催化的無機底物脫氫或脫電子後，直接進入呼吸鏈傳遞。這與異養微生物葡萄糖氧化要經過EMP和TCA等途徑的複雜代謝過程不同。②呼吸鏈的組分更為多樣化，氫或電子可從任一組分進入呼吸鏈。③產能效率即P／O比一般要比異養微生物更低。

　　化能自養微生物種類很多，現以研究得較清楚的化能自養菌——硝化細菌和硫桿菌為例來加以說明。

　　（1）硝化細菌的能量代謝 Nitrobacter（硝化桿菌屬）以亞硝酸作為能源，由於NO^2-　→NO^3-　中只涉及2個電子的傳遞，所以對其機制研究得較為清楚。用同位素¹⁸　O的實驗證明，在NO^2-　氧化為NO^3-　的過程中，氧來自水分子而非空氣。當NO^2-　+H₂　O→H₂　O·NO^2-　→NO^3-　+2H⁺　+2e時，由於NO^2-　的氧化還原電位很高，故H⁺　和e只能從與其相當的Cyt．a₁　部位進入呼吸鏈。2H⁺　+2e如果順著呼吸鏈傳遞至O₂　，僅能產生1個ATP。而對CO₂　還原所需要的大量還原力[H]則是通過H⁺　+e的逆呼吸鏈傳遞並消耗大量ATP後才能形成（圖6-32）。由此不難理解，為什麼硝化細菌的能量效率、生長速度和細胞產率是如此的低，同時還解釋了為什麼在硝化作用旺盛的土壤中，卻只能找到很少量的硝化細菌菌體。

　　（2）硫細菌的能量代謝 硫細菌尤其是Thiobacillus（硫桿菌屬）的能量代謝的研究近年來有很大進展。由於所有的硫桿菌都能在中性條件下以易溶於水且易測定的硫代硫酸鹽作為能源，所以有利於開展對其代謝機制的研究。

　　硫桿菌一般並不存在底物水平的磷酸化，即使存在磷酸腺苷硫酸鹽或APS途徑，也不起主要作用。它們氧化無機硫化物的主要方式是通過呼吸鏈的氧化磷酸化途徑。硫桿菌呼吸鏈的組成基本上與線粒體和原核生物中的Paracoccusdenitrificans（脫氮副球菌）等革蘭氏陰性異養細菌相似，即NADH₂　脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、黃素蛋白（FP）、泛醌（CoQ）、細胞色素b（有的含2種）、細胞色素氧化酶aa₃　等。在大多數硫桿菌中，從硫化物或硫代硫酸鹽底物上脫下的電子經細胞色素C進入呼吸鏈，但在T．denitrificans中卻例外地從黃素蛋白或細胞色素b水平上進入的。

能產生1個ATP。與硝化細菌等其他自養菌一樣，硫桿菌還原CO₂　所需要的還原力[H]，也是通過耗ATP的逆呼吸鏈傳遞而產生的。

　　2．光能自養型在討論光能自養微生物的能量代謝前，有必要先簡單介紹一下在自然界中具有光合作用的各類生物的特點和差異。現表解如下：

　　各種光合細菌都是原核生物，它們一齊被歸納在紅螺菌目（Rhodospirillales）中。它們不能利用H₂　O作為還原CO₂　的氫供體，只能利用還原態的H₂　S、H₂　或有機物作為氫供體，故光合作用中不產生O₂　，因而它們進行的是一種不產氧光合作用（anoxygenicphotosynthesis）。在它們的細胞（單細胞）內因所含的菌綠素和類胡蘿蔔素的量和比例的不同，使菌體呈現紅、橙、綠、藍綠、紫紅、紫或褐等顏色。這是一群典型的水生菌，廣泛地分布於深層（缺氧的）淡水或海水中。現將紅螺菌目的科和主要屬表解如下：

　　（1）循環光合磷酸化（cyclicPhotophosphorylation） 一種存在於厭氧光合細菌中的利用光能產生ATP的磷酸化反應，由於它是一種在光碟機動下通過電子的循環式傳遞而完成的磷酸化，故稱循環光合磷酸化。其特點是：①在光能的驅動下，電子從菌綠素分子上逐出後，通過類似呼吸鏈的循環，又回到菌綠素，其間產生了ATP；②產ATP與產還原力[H]分別進行；③還原力來自H₂　S等的無機氫供體；④不產生氧。

　　循環光合磷酸化的過程是：菌綠素分子在光照下被光量子所激發並逐出電子，這時菌綠素分子帶正電荷。被逐出的電子經鐵氧還蛋白、泛醌、細胞色素b和細胞色素f組成的類似於呼吸鏈的電子傳遞鏈傳遞後，重新返回帶正電荷的菌綠素分子。這是一個完整的循環過程，在此過程中的Cyt．b與Cyt．f間有ATP的合成。其整個過程及其與Calvin循環間的聯繫，見圖6-33。

　　（2）非循環光合磷酸化（noncyclicPhotophosphorylation） 這是各種綠色植物、藻類和藍細菌所共有的利用光能產生ATP的磷酸化反應。其特點是：①電子的傳遞途徑屬非循環式的；②在有氧條件下進行；③有兩個光合系統，其中的色素系統Ⅰ（含葉綠素a）可以利用紅光，色素系統Ⅱ（含葉綠素b）可利用藍光；④反應中同時有ATP（產自系統Ⅱ）、還原力[H]（產自系統Ⅰ）和O₂　產生；⑤還原力NADPH₂　中的[H]是來自H₂　O分子光解後的H⁺　和e^-　。

　　非循環光合磷酸化的過程是：H₂　O通過光解作用產生了1／2O₂　+2H⁺　+2e^-　，其中的電子經過兩個電子傳遞系統（Ⅰ和Ⅱ）接連傳遞，最終將電子傳遞給NADP⁺　接受，於是產生了NADPH+H⁺　，為還原CO₂　提供了還原力，同時，在電子傳遞過程中還有兩處發生光合磷酸化反應，產生供CO₂　還原用的ATP。在兩個傳遞系統中，系統Ⅱ有O₂　和ATP產生，系統Ⅰ則有NADPH₂　和ATP產生。整個過程見圖6-34。

　　（3）嗜鹽菌紫膜的光合作用 這是一種直至70年代才揭示的只有嗜鹽菌才有的無葉綠素或菌綠素參與的獨特光合作用。嗜鹽菌是一類必須在高鹽（3.5～5.0mol／LNaCl）環境中才能生長的古細菌（archaebacteria，參見第十一章）。它們廣泛分布在鹽湖、曬鹽場或鹽腌海產品上，常見的鹹魚上的紫紅斑塊就是嗜鹽菌的細胞群。主要代表有Halobacteriumhalobium（鹽生鹽桿菌）和H.cutirubrum（紅皮鹽桿菌）等。

　　H.halobium是一種能運動的桿菌，因其細胞內含類胡蘿蔔素而使細胞呈紅色、桔黃色或黃色。它們的細胞膜製備物可分成紅色與紫色兩部分，前者主要含細胞色素和黃素蛋白等用於氧化磷酸化的呼吸鏈載體，後者則十分特殊，在膜上呈斑片狀（直徑約0.5μm）獨立分布，其總面積約佔細胞膜面積的一半，這就是能進行獨特光合作用的紫膜。含量占紫膜75％的是一種稱作細菌視紫紅質（bacteriorhodopsin）的蛋白質，它與人眼視網膜上柱狀細胞中所含的一種蛋白質——視紫紅質（rhodopsin）十分相似，兩者都以紫色的視黃醛（retinal）作輔基。

　　從70年代起，人們對視紫紅質的功能作了研究並獲得了重大的發現。首先，人們從有氧和無氧條件下對四種生理類型的微生物進行照光和黑暗培養，並測定其ATP的合成（表6-6）。結果發現，H.halobium可以生長在光照和氧都具備的條件下，但不能生長在兩者都不存在的情況下。這就說明，嗜鹽菌可通過兩條途徑獲取能量，一條是有氧存在下的氧化磷酸化途徑，另一條是有光存在下的某種光合磷酸化途徑。實驗還發現，在波長為550～600nm的光照下，其ATP合成速率最高，而這一波長範圍恰與細菌視紫紅質的吸收光譜相一致。

　　目前認為，細菌視紫紅質與葉綠素相象，在光量子的驅動下，具有質子泵的作用，這時它將產生的H⁺　推出細胞膜外，使紫膜內外造成一個質子梯度差。根據化學滲透學說，這一質子動勢在驅使H⁺　通過ATP合成酶進入膜內而得到平衡時，就可合成細胞的通用能源ATP（圖6-35）。嗜鹽菌只有在環境中O₂　濃度很低和有光照條件下才合成其紫膜。這時，通過正常的氧化磷酸化已無法滿足其能量需要，因而轉由紫膜的光合磷酸化來提供。

　　通過紫膜的光能轉化而建立起來的質子梯度（△p）除了可驅動ATP合成外，還可為嗜鹽菌在高鹽環境下建立跨膜的Na⁺　電化學梯度（△μNa⁺　），並由此而完成一系列的生理生化功能（圖6-36）。

　　嗜鹽菌紫膜光合磷酸化功能的發現，使在經典的葉綠素和菌綠素所進行光合磷酸化之外又增添了一種新的光合作用類型。紫膜的光合磷酸化是迄今所知道的最簡單的光合磷酸化反應，這是研究化學滲透作用的一個極好的實驗模型，對它的研究正在大力開展。對其機制的揭示，將是生物學基本理論中的又一項重大突破，並無疑會對人類的生產實踐例如太陽能的利用和海水的淡化等帶來巨大的推動力。

　　（二）自養微生物的CO₂　固定

　　各種自養微生物在生物氧化後所取得的能量主要用於CO₂　固定。在微生物中，至今已了解的CO₂　固定的途徑有三條*，即Calvin循環、厭氧乙醯輔酶A途徑和還原性三羧酸循環途徑，現簡述如下。1．Calvin循環（Calvincycle）也稱Calvin-Bussham循環、核酮糖二磷酸途徑或還原性戊糖循環。這一循環是光能自養生物和化能自養生物固定CO₂　的主要途徑。磷酸核酮糖激酶和核酮糖羧化酶是本途徑的特有酶。利用Calvin循環進行CO₂　暗固定的生物除了綠色植物、藍細菌和絕大多數光合細菌外，還包括全部好氧性的化能自養菌，因此十分重要。

　　Calvin循環的整個過程可分三個階段。

　　（1）羧化反應 3個核酮糖-1，5-二磷酸（Ru-1，5-P）通過核酮糖二磷酸羧化酶將3個CO₂　固定，並轉變成6個3-磷酸甘油酸分子。

　　在循環中，這一基本反應進行3次，就可利用摻入的3個CO₂　分子凈產1個C₃　分子。

　　（2）還原反應 緊接在羧化反應後，立即發生3-磷酸甘油酸上羥基還原成醛基的反應。這種轉化是經過逆向EMP途徑進行的，即通過3-磷酸甘油酸激酶和ATP使其磷酸化成1，3-二磷酸甘油酸，然後再通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶用NAD（P）H₂　使1，3-二磷酸甘油酸還原成甘油醛-3-磷酸。形成1個甘油醛-3-磷酸分子需要消耗6個ATP和6個NAD（P）H₂　。

　　（3）CO₂　受體的再生 在循環中除凈產1個甘油醛-3-磷酸可進一步通過EMP途徑的逆轉而形成葡萄糖分子外，其餘5個分子經過複雜的反應並消耗3個ATP後，最終再生出3個核酮糖-1，5-二磷酸分子，以便重新接受CO₂　分子。

　　如果以產生1個葡萄糖分子來計算，則Calvin循環的總式為：

6CO₂　+12NAD（P）H₂　+18ATP→C⁶H₁₂O⁶　+12NAD（P）+18ADP+18Pi

　　現把經精簡後的Calvin循環途徑列在圖6-37中。

　　Calvin循環的最初產物是甘油醛-3-磷酸，然後再進一步合成細胞所需要的各種成分，即：

　　2．厭氧乙醯-輔酶A途徑 厭氧乙醯輔酶A途徑（anaerobicacetyl-CoApathway）又稱活乙酸途徑（activatedaceticacidPathway）。這是近年來在一些能利用氫的嚴格厭氧菌包括產甲菌、硫酸鹽還原菌和產乙酸菌中發現的新的自養CO₂　還原途徑。它們不存在Calvin循環，因由乙醯-輔酶A途徑來擔任CO₂　還原功能。實驗是用Methanobacteriumthermoautotrophicum（熱自養甲烷桿菌）並結合同位素方法來進行的。初步研究的結果見圖6-38。

　　從圖6-38中可以看出，在厭氧乙醯-輔酶A的CO₂　還原途徑中，1分子CO₂　先被還原力[H]（通過含F₄₂₀因子①或NADP的酶所轉移）還原成甲醇水平（甲基-X），另一分子CO₂　則被一氧化碳脫氫酶還原成一氧化碳。通過甲基-X的羧化產生乙醯-X，進而形成乙醯-COA，在丙酮酸合成酶的催化下，由乙醯-CoA接受第3個CO₂　分子而羧化成丙酮酸。然後就可由丙酮酸通過已知代謝途徑去合成細胞所需要的各種有機物。

　　3．還原性TCA循環途徑 通過還原性TCA循環（reductivetricarboxylicacidcycle）而固定CO₂　的途徑只是在少數光合細菌例如Chlorobiumthiosulfatophilum（嗜硫代硫酸鹽綠菌）中才能找到。在這一途徑中，CO₂　通過琥珀醯-COA的還原性羧化作用而被固定，即：

　　值得指出的是，通過對以上三類自養微生物CO₂　固定的比較後，發現厭氧CO₂　固定要比好氧CO₂　固定更為經濟有效。例如，3molCO₂　經厭氧的乙醯-輔酶A途徑合成1mol甘油醛-3-磷酸只需要消耗3molATP；通過還原性TCA循環途徑相應地需要5molATP；而通過Calvin循環則需要9molATP。

第二節 分解代謝和合成代謝間的聯繫

　　在本章一開始就已講過，分解代謝與合成代謝間有著極其密切的聯繫。可以說，分解代謝的功能在於保證正常合成代謝的進行，而合成代謝又反過來為分解代謝創造了更好的條件，兩者相互聯繫，促進了生物個體的生長繁殖和種族的繁榮發展。分解代謝和合成代謝的相互關係可見圖6-39。

　　在分解代謝的三類產物中，有關能量（ATP）及還原力[H]問題已在第一節中作了較詳細的討論，本節將著重討論聯結分解與合成代謝的一些重要中間代謝物的來源。這些中間代謝物一共有12種（表6-7），如果在生物體中只進行能量代謝，則有機能源的最終結局只是產生ATP、H₂　O和CO₂　，這時便沒有任何中間代謝物可供累積，因此，合成代謝也不可能正常進行。相反，如果要進行正常的合成代謝，又須抽走大量為分解代謝正常進行所必需的中間代謝物，結果也勢必影響具有循環機制的分解代謝的正常運轉。

　　為解決上述矛盾，生物體在其長期進化過程中，發展了以下兩類獨特功能的代謝途徑。

一、兼用代謝途徑（amphibolic pathway）

　　凡在分解代謝和合成代謝中具有雙重功能的途徑，就稱兼用代謝途徑。從表6-7中可知，EMP、HMP和TCA循環是重要的兼用代謝途徑。例如，TCA循環不僅包含著丙酮酸和乙醯-CoA的氧化，而且還包含了琥珀醯-CoA、草醯乙酸和α-酮戊二酸等的產生，它們是合成氨基酸和卟啉等化合物的重要中間代謝物；又如，葡萄糖通過EMP途徑可以分解為2個丙酮酸，反之，兩個丙酮酸也可通過EMP途徑的逆轉而合成1個葡萄糖，這就是葡糖異生作用（gluconeogenesis）。必須指出的是，①在兼用代謝途徑中，合成途徑並非分解途徑的完全逆轉，即催化兩個方向中的同一反應並不是總是用同一種酶來進行的。例如，在上述的葡糖異生作用中，有兩個酶與分解代謝時不同，即由果糖二磷酸酯酶（而不是磷酸果糖激酶）來催化果糖-1，6-二磷酸至果糖-6-磷酸的反應，而由葡萄糖-6-磷酸酯酶（而不是己糖激酶）來催化葡萄糖-6-磷酸至葡萄糖的反應。②在分解與合成代謝途徑中，在相應的代謝步驟中，往往還包含了完全不同的中間代謝物。③在真核生物中，合成代謝和分解代謝一般在細胞的不同區域中分隔進行，即合成代謝一般在細胞質中進行，而分解代謝則多在線粒體和微粒體中進行，這就有利於兩者可同時有條不紊地運轉。原核生物因其細胞結構上的間隔程度低，故反應的控制主要在簡單的酶分子水平上進行（見第四節）。

二、代謝物回補順序（anaplerotic sequence）

　　微生物在正常情況下，為進行生長、繁殖的需要，必須從分解代謝途徑中取得大量中間代謝物以滿足其合成細胞基本物質——糖類、氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和維生素等的需要。這樣一來，勢必又造成了分解代謝不能正常運轉並進而影響產能功能的嚴重後果。例如，在TCA循環中，如果因合成谷氨酸而抽去了α-酮戊二酸，就會使循環中斷。中間代謝物的回補順序就是為解決這一矛盾而發展起來的。所謂回補順序，又稱補償途徑或添補途徑（replenishmentpathway），就是指能補充兼用代謝途徑中因合成代謝而消耗的中間代謝物的反應。這樣，當重要產能途徑中的關鍵中間代謝物必須被大量用作生物合成的原料時，仍可保證能量代謝的正常進行。例如，在通常情況下，TCA循環中約有一半的中間代謝物被抽作合成氨基酸和嘧啶的原料。

　　不同的微生物和在不同的碳源條件下，有不同的回補順序。與EMP和TCA循環有關的回補順序約有10條，它們都圍繞著回補EMP途徑中的磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和TCA循環中的草醯乙酸（oxaloacetate，OA）這兩種關鍵性中間代謝物。現將其中最重要的途徑表解如下：

　　（一）合成草醯乙酸（OA）的回補順序

　　草醯乙酸是保證TCA循環正常運轉中的一個關鍵性中間代謝物，缺少它時，乙醯-CoA就無法進入此循環，從而不能產能或形成其他中間代謝物。合成草醯乙酸的回補順序有以下兩類。

　　1．用葡萄糖或3碳化合物作碳源合成OA 當微生物生長在葡萄糖或其他3碳化合物如丙酮酸、乳酸或甘油等碳源上時，可以利用以下兩條途徑來補充草醯乙酸：

　　（1）由PEP羧化酶（PEPcarboxylase）催化磷酸烯醇丙酮酸為草醯乙酸。

　　（2）由丙酮酸羧化酶（Py carboxylase）催化丙酮酸為草醯之酸

　　2．用乙酸等2碳化合物作碳源合成OA 以乙酸、乙醇、烴類或脂肪酸等2碳化合物作為唯一碳源上的微生物，例如許多細菌、真菌、藻類和原生動物等，其產生草醯乙酸的回補順序是由獨特的乙醛酸循環（glyoxy-latecycle）或稱Krebs-Kornberg循環來完成的。

　　凡能利用乙酸為唯一碳源或能源的微生物，都證明存在著乙醛酸循環。這類微生物的種類很多，如細菌中的Acetobacter（醋桿菌屬）、Azotobacter（固氮菌屬）、E.coli、Enterobacteraerogenes（產氣腸桿菌）、Paracoccusdenitrificans（脫氮副球菌）、Pseudomonasfluorescens（熒光假單胞菌）和Rhodospirillum（紅螺菌屬）等，真菌中的Saccharomyces（酵母屬）、Aspergillusniger（黑麴黴）和Penicillium（青黴屬）等。

　　乙醛酸循環這種回補順序主要是通過兩種獨特酶來實現的。其一是異檸檬酸裂合酶（isocitratelyase），它催化異檸檬酸裂解成琥珀酸和乙醛酸的反應：

　　另一為蘋果酸合梅，它催化2個2碳化合物——乙醯-CoA和乙醛酸縮合為蘋果酸的反應：

　　通過這兩種酶的合作，就可把1分子異檸檬酸和1分子乙醯-CoA轉化成2分子4碳二羧酸，然後再進一步借蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶轉化成丙酮酸或借磷酸烯醇丙酮酸激酶轉化成磷酸烯醇丙酮酸，從而可通過葡糖異生作用合成葡萄糖，另一方面它們還可供檸檬酸合酶合成草醯乙酸，從而為生物合成提供更多的原料。乙醛酸循環常與TCA循環同時存在，相互補充，藉以充分發揮TCA循環的產能功能和乙醛酸循環的中間代謝物回補功能（圖6-40）。

　　從圖6-40中可知，乙醛酸循環每周轉一次可把2個2碳化合物（乙酸）合成1個4碳化合物（琥珀酸），即：

　　（二）合成磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的回補順序

　　磷酸烯醇丙酮酸是EMP途徑中的重要中間代謝物。當PEP的來源充足時，微生物就可通過合適反應合成有關成分，也可通過葡糖異生作用合成己糖。

　　1．用葡萄糖或3碳化合物作碳源合成PEP

　　（1）丙酮酸通過磷酸烯醇丙酮酸合酶（PEPsynthase）產生磷酸烯醇丙酮酸

　　（2）丙酮酸通過丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvatephosphatedikinase）產生磷酸烯醇丙酮酸

　　2．用乙酸等2碳化合物作碳源合成PEP 當某些微生物生長在以2碳化合物乙酸等作為唯一碳源的培養基上時，它們可以通過上述的乙醛酸循環合成草醯乙酸，有了草醯乙酸後，就可以進一步通過以下兩種途徑產生磷酸烯醇丙酮酸。

　　（1）草醯乙酸由PEP羧激酶（PEPcarboxykinase）催化產生磷酸烯醇丙酮酸

　　（2）草醯乙酸由PEP羧轉磷酸酶（PEPcarboxytransphosphorylase）催化產生磷酸烯醇丙酮酸

　　以上已較詳細地把若干最重要的中間代謝物的回補順序作了介紹，現把它們綜合在圖6-41中。

第三節 微生物獨特合成代謝途徑舉例

　　對一切生物所共有的重要物質如糖類、蛋白質、核酸、脂類和維生素等的合成代謝知識是生物化學課程的重點討論內容，因此不打算在這裡重複。本章要討論的只是為微生物所特有的合成代謝類型，它們的種類很多，例如生物固氮，各種結構大分子、細胞貯藏物和很多次生代謝產物的生物合成等。以下我們僅選其中的生物固氮和細菌細胞壁肽聚糖的生物合成為例來作比較詳細的介紹。

一、生物固氮

　　如果把光合作用看作是地球上最重要的生物化學反應的話，則生物固氮應當是地球上僅次於光合作用的第二個最重要的生物化學反應。生物固氮是指分子氮通過固氮微生物固氮酶系的催化而形成氨的過程。這是一種極其溫和的生物化學反應，它比人類發明的利用鐵催化劑、在高溫（約300℃）、高壓（約300個大氣壓）下的化學固氮要優越得多。

　　（一）固氮微生物的種類自1886年M．W．Beijerinck分離到共生固氮的根瘤菌後，至今所研究過的固氮生物約有50多屬和100多種，它們都是原核生物。以下分別按自生固氮菌（能獨立進行固氮的微生物）、共生固氮菌（必須與它種生物共生在一起時才能固氮的微生物）和聯合固氮菌（必須生活在植物根際、葉面或動物腸道等處才能進行固氮的微生物）三類分別來作表解式的介紹。

　　1．自生固氮菌

　　2．共生固氮菌

　　* 表解中列出的許多屬並不是它所包括的所有種都能固氮。

　　3．聯合固氮菌

　　（二）固氮的生化機制

　　生物固氮是一個極其重要的生化反應過程，因此一向受到研究者的高度重視。可是長期來由於對固氮酶這種生物催化劑的高度氧敏感性未予認識，因此無法進行深入研究。1960年，J．E．Carnahan等從Clostridiumpasteurianum（巴氏梭菌）這一厭氧菌中獲得了具有固氮活性的無細胞抽提液，實現了分子氮還原為氨的實驗。1966年，L．Mortenson等從C．pasteurianum和Azoto-bactervinelandii（維涅蘭德固氮菌）的細胞抽提液中，分離出兩種半純的固氮蛋白——鉬鐵蛋白和鐵蛋白。至1970年，R．C．Burns等才獲得固氮鉬鐵蛋白的白色針狀結晶。從此，固氮的生化和遺傳機制的研究才蓬勃開展起來。

　　（1）ATP的供應 固氮過程中需要消耗大量的能量，據試驗，固定1molN2約要消耗10～15molATP。這些ATP是由呼吸、厭氧呼吸、發酵或光合作用所提供的。

　　（2）還原力[H]及其載體 固氮過程所需要的大量還原力[H]或電子由NAD（P）H2所提供，它們由電子載體鐵氧還蛋白（Fd，ferredoxin）或黃素氧還蛋白（Fld，flavodoxin）傳遞至鐵蛋白。此外，H₂（在氫化酶作用下形成H⁺e）、丙酮酸、甲酸、連二亞硫酸鹽（一種人工還原劑）或異檸檬酸等也可在不同微生物中作為氫供體。Fd或Fld是一類在低氧化還原勢下的電子傳遞體。Fd是一種鐵硫蛋白，它存在於許多微生物中，含等摩爾的鐵和不穩態硫（在酸化時能以H₂S形式釋放），參與固氮、光合作用以及釋放和利用H₂的反應；而Fld則是一種黃素蛋白，在許多反應中有取代Fd的功能。每1分子Fld中含1分子FMN，但不含金屬或不穩態硫。此外，在A．vinelandii中，還含有一種特殊的Fld，稱為「固氮黃素」（azotoflavin）。

　　（3）固氮酶（nitrogenase） 從各種不同生理類型的固氮微生物中，都可以抽提到結構相同的固氮酶。它含有兩種成分——組分Ⅰ（P1）和組分Ⅱ（P₂）。組分Ⅰ是真正的「固氮酶」，又稱鉬鐵蛋白（MF）或鉬鐵氧還蛋白（MoFd，molebdoferredoxin）；組分Ⅱ實質上是一種「固氮酶還原酶」，又稱鐵蛋白（F）或固氮鐵氧還蛋白（AzoFd，azoferredoxin）。有關組分Ⅰ和組分Ⅱ的結構、功能及其活性中心等的比較可見表6-8。

　　（4）還原底物N₂（有NH₃存在時會抑制固氮作用）

　　（5）鎂離子

　　（6）嚴格的厭氧微環境

　　2．固氮酶活力的測定測定固氮酶活力的方法很多。經典的方法有粗放的微量克氏定氮法和煩瑣的同位素法等。1966年，M．J．Dilworth和R．Scholhorn等分別發表了既靈敏又簡便的乙炔還原法來測定固氮酶的活性，從而大大促進了固氮生化的研究。

　　已知所有的固氮酶除了能催化N₂→NH₃的反應外，還能催化以下多種有關反應：

　　①N₂O→N₂+H₂O

　　②N^3-→N₂+NH₃

　　③C₂H₂→C₂H₄

　　④HCN→CH₄+NH₃+[CH₃NH₂]

　　⑤CH₃NC→CH₄+CH₃NH₂+[C₂H₄，C₂H₆]

　　在其中的C₂H₂（乙炔）→C₂H₄（乙烯）反應中，這兩種氣體即使在很低濃度下，也能方便地用氣相色譜儀測定出來。由於此反應的靈敏度高、設備簡單、成本低廉和操作簡便，使之迅速成為各固氮研究實驗室中的常規方法，它不僅可用於純酶製劑固氮活力的測定，也可用於天然固氮生態系統固氮活力的研究。

　　3．固氮的生化途徑固氮反應的總式為：

N₂+6e+6H⁺+12ATP→2NH₃+12ADP+12Pi

　　固氮過程及其細節可見圖6-42。

　　從圖6-42中可以看出，整個固氮過程主要有以下幾個環節：①由Fd或Fld向氧化型組分Ⅱ的鐵原子提供一個電子，使其還原；②還原型的組分Ⅱ與ATP-Mg結合後，改變了自己的構象；③組分Ⅰ在含Mo的位點上與分子氮結合，並與組分Ⅱ-Mg-ATP複合物反應，形成一個1∶1複合物，即固氮酶；④在固氮酶分子上，有一個電子從組分Ⅱ-Mg-ATP複合物轉移到組分Ⅰ的鐵原子上，使組分Ⅱ重新轉變成氧化態，同時ATP也就水解成ADP+Pi；⑤通過以上電子轉移過程連續6次（用打點子的箭頭表示）的運轉，才可使組分Ⅰ釋放出2個NH₃分子。還須指出的是，在以上過程中，固氮酶必須始終受活細胞中各種「氧障」的嚴密保護，以防固氮酶遇氧分子而發生不可逆的失活。

　　N₂分子經固氮酶的催化而還原成NH₃後，就可通過下述途徑（圖6-43）與相應的酮酸結合而形成各種氨基酸。

　　圖6-43的總反應為：NH⁴⁺+α-酮酸→相應的氨基酸。例如，由丙酮酸形成丙氨酸，由α-酮戊二酸形成谷氨酸，由草醯乙酸形成天冬氨酸等。有了氨基酸後，就可進一步合成蛋白質和其他有關化合物了。

　　4．固氮酶的氫反應固氮酶除能催化N₂→NH₃外，還具有催化2H⁺→H₂反應的氫酶活性。當固氮菌生活在缺N₂條件下時，其固氮酶可將H⁺全部還原成H₂；在有N₂條件下，固氮酶也總是只把75％的還原力[H]去還原N₂，而把另外25％的[H]以形成H₂的方式浪費掉了：

N₂+8H⁺+8e+16Mg-ATP→2NH₃+H₂+16Mg-ADP+16Pi

　　然而，在大多數的固氮菌中，還含有另一種經典的氫酶，它能將被固氮酶浪費的分子氫重新激活，以回收一部分還原力[H]和ATP。

　　（三）好氧性固氮菌固氮酶的抗氧機制

　　前已述及，固氮酶的兩個蛋白組分對氧是極端敏感的，而且一旦遇氧就很快導致不可逆的失活，例如，組分Ⅱ（鐵蛋白）一般只要在空氣中暴露45秒鐘即會喪失一半活性，組分Ⅰ（鉬鐵蛋白）雖稍穩定，但一般在空氣中的活性半衰期也只有10分鐘。當然，來自不同微生物的鉬鐵蛋白，其氧敏感性是不同的（表6-9）。

　　事實上，大多數的固氮菌都是好氧菌，它們需要利用氧氣進行呼吸和產生能量。固氮菌在其漫長的進化過程中，發展出多種機制來解決其既需要氧又須防止氧對固氮酶損傷的矛盾。

　　1．好氧性自生固氮菌的保護機制

　　（1）呼吸保護 指固氮菌以較強的呼吸作用迅速地將周圍環境中的氧消耗掉，使細胞周圍微環境處於低氧狀態，並以此來保護固氮酶不受氧的損傷。

　　屬於固氮菌科（Azotobacteriaceae）的固氮菌，都有特別高的呼吸強度。例如，把生長在低氧分壓下的A．vinelandii突然轉移到高氧分壓條件下時，可發現其呼吸強度和NADPH₂脫氫酶活性同時增高，細胞色素a₂的含量也增加，而氧化磷酸化的效率卻明顯降低。其原因是細胞動用了一套以耗費碳源來去除氧以保護固氮酶的呼吸系統，據研究，這是因為它們利用了一條分支的、與磷酸化解偶聯的呼吸鏈。

　　（2）構象保護 當固氮菌處於高氧分壓環境下時，其固氮酶能形成一個無固氮活性但能防止氧損傷的特殊構象，稱為構象保護。在對A．vinelandii和A．chroococcum的研究中，發現固氮酶的構象保護是由於該酶與一個或幾個蛋白質或磷脂等穩定因子的結合而引起的。例如，已在這兩種菌中分離和純化了具有構象保護功能的蛋白因子，即Fe-S蛋白Ⅱ。它是一種2Fe-2S的耐氧蛋白。來源於A．vinelandii的，稱AvP（分子量為15000，是單體），來源於A．chroococcum者，稱AcP（分子量為24000～30000，有兩個亞基）。實驗發現，當Fe-S蛋白Ⅱ與固氮酶的鐵蛋白和鉬鐵蛋白都處於氧化狀態且有Mg²⁺存在時，三者可形成耐氧的大分子複合物。反之，當它們處於還原狀態時，可發生解離，並重新出現固氮活性。

　　呼吸保護與構象保護兩者相互協調，組成一個「雙保險」式的保護機制。在一般情況下，可通過呼吸保護來去除多餘的氧，如果它還不足以去除過量分子氧時，則可進一步利用構象保護使固氮酶達到可逆性抑制狀態，以渡過不良的環境條件。

　　2．藍細菌固氮酶的保護 藍細菌是一類放氧性光合生物（oxygenicphototrophs），在光照下，會因光合作用放出的氧而使細胞內氧濃度增高，但同時它又有厭氧的固氮系統，因此，在其長期進化過程中就發展出種種保護固氮酶免受氧損傷的獨特機制。

　　（1）分化出特殊的還原性異形胞 在第二章第三節中，我們已初步討論過藍細菌異形胞的結構和功能。在具有異形胞分化的藍細菌中，固氮作用只有在異形胞中才能進行。異形胞的體積較營養細胞大，細胞外有一層由糖脂組成的片層式的較厚外膜，它具有阻止氧氣擴散入細胞內的物理屏障作用；異形胞內缺乏產氧光合系統Ⅱ，加上脫氫酶和氫酶活性高，使異形胞能維持很強的還原態；其中超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，簡稱SOD，詳見第七章第三節）的活性很高，有解除氧毒害的功能；此外，異形胞還有比鄰近營養細胞高出約2倍的呼吸強度，藉此可消耗過多的氧和產生對固氮所必要的ATP。

　　（2）非異形胞藍細菌固氮酶的保護 這類藍細菌一般缺乏獨特的防止氧對固氮酶的損傷機制。在它們之中，有的採用將固氮作用與光合作用進行時間上的分隔（黑暗下固氮，光照下進行光合作用），如（織線藍菌屬）等；有的則形成束狀群體，在其中央處於厭氧環境下的細胞失去光合系統Ⅱ，有利於固氮酶在微氧環境下進行固氮作用，如Trichodesmium（束毛藍菌屬）；有的則在固氮酶活性高時，細胞內用以除去有毒過氧化物的過氧化物酶和SOD的活力也均提高，如Gloeocapsa（粘球藍菌屬）等。

　　3．根瘤菌固氮酶的抗氧保護

　　（1）豆科植物共生根瘤菌 根瘤菌以只能生長不能分裂的類菌體（bacteroids）形式存在於豆科植物的根瘤中。許多類菌體被包在一層類菌體周膜（peribacterialmembrane，簡稱pbm）中，維持了一個良好的氧、氮和營養環境。最重要的是在這層膜的內外都存在著一種獨特的豆血紅蛋白（leghaemoglobin）。豆血紅蛋白是一種氧結合蛋白，可將氧輸送給根瘤中的類菌體，由於它與氧的親合力極強（可使氧濃度比周圍環境降低8萬倍），因此，又可防止局部氧濃度增高，從而避免了固氮酶被氧所損傷。豆血紅蛋白就像一種緩衝劑，可在根瘤中調節氧的濃度，使它穩定在對固氮酶最合適的範圍內。已知在豆血紅蛋白中的蛋白部分是由根瘤菌觸發，再由植物基因所編碼和合成，而其血紅素部分則由植物所觸發，再由根瘤菌基因所編碼和合成，兩者達到極其默契的共生狀態。

　　（2）非豆科植物共生根瘤菌 1973年才發現的一種生長在非洲的榆科植物——Parasponia（糙葉山黃麻），是首次發現的在根瘤中共生著根瘤菌（豇豆根瘤菌）的非豆科植物。在其根瘤中雖未發現豆血紅蛋白，但卻含有能可逆地與氧相結合的植物血紅蛋白，它在菌體內也起著氧載體的作用。在赤楊、楊梅、木麻黃等非豆科木本植物的根瘤中，存在著共生的Frankia（弗蘭克氏菌屬）放線菌。目前初步知道Frankia的營養菌絲的末端可膨大成一球形囊，稱為泡囊，這是它的固氮部位。泡囊與藍細菌中的異形胞相似，具有保護固氮酶免受分子氧損傷的特殊功能。

二、微生物結構大分子——肽聚糖的合成

　　微生物所特有的結構大分子的種類很多，例如原核生物中的肽聚糖、磷壁酸、脂多糖以及各種莢膜成分等，真核生物中的葡聚糖、甘聚糖、纖維素和幾丁質等。

　　肽聚糖是絕大多數原核生物細胞壁所含有的獨特成分；它在細菌的生命活動中有著重要的功能（詳見第二章），尤其是許多重要抗生素例如青黴素、頭孢黴素、萬古黴素、環絲氨酸（惡唑黴素）和桿菌肽等呈現其選擇毒力（selectivetoxicity）的物質基礎；加之它的合成機制複雜，並在細胞膜外進行最終裝配步驟，因此，這裡就以它為例，來討論這一有代表性的微生物結構大分子是如何合成的。

　　整個肽聚糖合成過程的步驟極多（近20步），根據反應是在細胞質中、細胞膜上或是在細胞膜外進行，可把它明顯地劃分成三個階段（圖6-44）。

　　（一）在細胞質中的合成

　　1．由葡萄糖合成N-乙醯葡糖胺和N-乙醯胞壁酸

　　2．由N-乙醯胞壁酸合成「Park」核苷酸這一過程共有4步反應，它們都需尿嘧啶二磷酸（UDP）作為糖載體，另外還有合成D-丙氨醯-D-丙氨酸的2步反應，它們可被環絲氨酸（惡唑黴素）所抑制（圖6-45）。

　　（二）在細胞膜中的合成

　　由「Park」核苷酸合成肽聚糖單體分子是在細胞膜上進行的。由於細胞膜是疏水性的，所以，要把在細胞質中合成的親水性化合物「Park」核苷酸穿入細胞膜並進一步接上N-乙醯葡糖胺和甘氨酸五肽「橋」，最後把肽聚糖單體（即雙糖肽亞單位）插入到細胞膜外的細胞壁生長點處，必須通過一種稱作細菌萜醇（bactoprenol）的類脂載體的運送。

　　類脂載體是一種含11個異戊二烯單位的C₅₅類異戊二烯醇，它可通過兩個磷酸基與N-乙醯胞壁酸分子相接，使糖的中間代謝物呈現很強的疏水性，從而使它能順利通過疏水性很強的細胞膜並轉移到膜外。類脂載體的結構為：

　　類脂載體除在肽聚糖的合成中具有重要作用外，還可參與微生物多種胞外多糖和脂多糖的生物合成，例如細菌的磷壁酸、脂多糖，細菌和真菌的纖維素，以及真菌的幾丁質和甘露聚糖等。

　　由「Park」核苷酸合成肽聚糖單體可分3步進行，再加上有關步驟總計有5步，其詳細過程見圖6-46。

　　（三）在細胞膜外的合成

　　就象裝運到建築工地上的一個個「預製件」被逐個安裝到大廈上的適當部位就可組裝成一座雄偉壯麗的大廈那樣，從焦磷酸類脂載體上脫下來的肽聚糖單體，被運送到細胞膜外正在活躍合成肽聚糖的部位，在那裡，必須有現成的細胞壁殘餘（至少含有6～8個肽聚糖單體）作為引物，然後，肽聚糖單體與引物分子間先發生轉糖基作用（transglycosylation），使多糖鏈橫向延伸一個雙糖單位，然後再通過轉肽酶（transpeptidase）的轉肽作用（transpeptidation），再使前後兩條多糖鏈間通過形成甘氨酸五肽「橋」而發生縱向交聯。甲乙兩肽尾間的五甘氨酸肽橋是這樣形成的：通過轉肽酶的作用，在甲肽尾五甘氨酸肽的遊離氨基端與乙肽尾的第四個氨基酸——D-Ala的遊離羧基間形成一個肽鍵，而使兩者交聯。這時，乙肽尾從原有的五肽變成正常肽聚糖分子中的四肽尾了。必須指出的是，以上過程是以Staph．aureas為材料研究出來的，而在其他原核生物中還有別的肽橋類型或根本不存在什麼肽橋（見第二章）。有關轉糖基作用和轉肽作用的反應見圖6-47。

　　從圖6-47中可以看出，轉肽酶的轉肽作用可被青黴素所抑制。其作用機制是：青黴素是肽聚糖單體五肽尾末端的D-丙氨醯D-丙氨酸的結構類似物（圖6-48），它們兩者可相互競爭轉肽酶的活力中心。當轉肽酶與青黴素結合後，因前後兩個肽聚糖單體間的肽橋無法交聯，因此只能合成缺乏正常機械強度的缺損「肽聚糖」，從而形成了細胞壁缺損的細胞，例如原生質體或球狀體等，它們在滲透壓變動的不利環境下，極易因破裂而死亡。因為青黴素的作用機制在於抑制肽聚糖的生物合成，因此對處於生長繁殖旺盛期的微生物具有明顯的抑制作用，而對處於生長休止期的細胞（restcell），則無抑制作用。

第四節 微生物的代謝調控與發酵生產

　　微生物有著一整套可塑性極強和極精確的代謝調節系統，以保證上千種酶能正確無誤、有條不紊地進行極其複雜的新陳代謝反應。從細胞水平上來看，微生物的代謝調節能力要超過複雜的高等動植物。這是因為，微生物細胞的體積極小，而所處的環境條件卻十分多變，每個細胞要在這樣複雜的環境條件下求得生存和發展，就必須具備一整套發達的代謝調節系統。有人估計，在大腸桿菌細胞中，同時存在著2500種左右的蛋白，其中上千種是催化正常新陳代謝的酶。如果細胞平均使用蛋白質，由於每個細菌細胞的體積只夠裝約10萬個蛋白質分子，所以每種酶平均還分配不到100個分子。在長期進化過程中，微生物發展出一整套十分有效的代謝調節方式，巧妙地解決了這一矛盾。例如，在每種微生物的遺傳因子上，雖然潛在著合成各種分解酶的能力，但是除了一部分是屬於經常以較高濃度存在的組成酶（constitutiveen-zyme）外，大量的都是屬於只有當其分解底物或有關誘導物存在時才合成的誘導酶（induceden-zyme或inducibleenzyme）。據估計，誘導酶的總量約佔細胞總蛋白含量的10％。通過代謝調節，微生物可最經濟地利用其營養物，合成出能滿足自己生長、繁殖所需要的一切中間代謝物，並做到既不缺乏也不剩餘任何代謝物的高效「經濟核算」。

　　微生物細胞的代謝調節方式很多，例如可調節營養物質透過細胞膜而進入細胞的能力，通過酶的定位以限制它與相應底物的接近，以及調節代謝流等。其中以調節代謝流的方式最為重要，它包括兩個方面，一是「粗調」，即調節酶的合成量，二是「細調」，即調節現成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協調，以達到最佳調節效果。

　　利用微生物代謝調控能力的自然缺損或通過人為方法獲得突破代謝調控的變異菌株，可為發酵工業提供生產有關代謝產物的高產菌株。有關的實際例子將在本節後部分進行介紹。

　　以下將以原核生物為對象來討論微生物的代謝調節及其工業應用。

一、酶活性的調節

　　酶活性的調節是指在酶分子水平上的一種代謝調節，它是通過改變現成的酶分子活性來調節新陳代謝的速率，包括酶活性的激活和抑制兩個方面。酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，後面的反應可被較前面的中間產物所促進，例如Streptococcusfeacalis（糞鏈球菌）的乳酸脫氫酶活性可被果糖-1，6-二磷酸所促進，或Neu-rosporacrassa（粗糙脈孢菌）的異檸檬酸脫氫酶的活性會受檸檬酸促進等。酶活性的抑制主要是反饋抑制（feed-backinhibition），它主要表現在某代謝途徑的末端產物（即終產物）過量時，這個產物可反過來直接抑制該途徑中第一個酶的活性，促使整個反應過程減慢或停止，從而避免了末端產物的過多累積（圖6-49）。反饋抑制具有作用直接、效果快速以及當末端產物濃度降低時又可重新解除等優點。

　　（一）反饋抑制的類型

　　1．直線式代謝途徑中的反饋抑制 這是一種最簡單的反饋抑制類型。例如E．coli在合成異亮氨酸時，因合成產物過多可抑制途徑中第一個酶——蘇氨酸脫氨酶的活性，從而使α-酮丁酸及其後一系列中間代謝物都無法合成，最終導致異亮氨酸合成的停止（圖6-50）；另外，Corynebacteriumglutamicum（谷氨酸棒桿菌）利用谷氨酸合成精氨酸也是直線式反饋抑制的典型例子。

　　2．分支代謝途徑中的反饋抑制在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為複雜。為避免在一個分支上的產物過多時不致同時影響另一分支上產物的供應，微生物已發展出多種調節方式。

　　（1）同功酶調節 同功酶（isoenzyme）又稱同工酶，是指能催化相同的生化反應，但酶蛋白分子結構有差異的一類酶，它們雖同存於一個個體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。同功酶的主要功能在於其代謝調節。在一個分支代謝途徑中，如果在分支點以前的一個較早的反應是由幾個同功酶所催化時，則分支代謝的幾個最終產物往往分別對這幾個同功酶發生抑制作用。如圖6-51中A→B的反應由三個同功酶a、b、c所催化，它們分別受最終產物E、G、H所抑制，這樣，當環境中只有一種最終產物過多時就只能抑制相應酶的活力，而不致影響其他幾種最終產物的形成。

　　通過同功酶進行反饋抑制的實例很多，例如在E．coli的賴氨酸和蘇氨酸合成中，天冬氨酸激酶Ⅰ和同型絲氨酸脫氫酶Ⅰ可被蘇氨酸所抑制；天冬氨酸激酶Ⅲ可被賴氨酸所抑制（見圖6-52）。

　　（2）協同反饋抑制（concertedfeedbackinhibition） 指分支代謝途徑中的幾個末端產物同時過量時才能抑制共同途徑中的第一個酶的一種反饋調節方式（圖6-53）。例如Corynebacteriumglutamicum或Bacilluspolymyxa（多粘芽孢桿菌）在合成天冬氨酸族氨基酸時，天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協同反饋抑制，如果僅蘇氨酸或賴氨酸過量，並不能引起抑制作用。

　　（3）合作反饋抑制（cooperativefeedbackinhibition） 又稱增效反饋抑制，系指兩種末端產物同時存在時，可以起著比一種末端產物大得多的反饋抑制作用（圖6-54）。例如，AMP和GMP雖可分別抑制PRPP（磷酸核糖焦磷酸酶），但兩者同時存在時抑制效果卻要大得多。

　　（4）累積反饋抑制（cumulativefeedbackinhibition） 每一分支途徑的末端產物按一定百分率單獨抑制共同途徑中前面的酶，所以當幾種末端產物共同存在時，它們的抑制作用是累積的。在各末端產物之間既無協同效應，亦無拮抗作用（圖6-55）。

　　累積反饋抑制最早在E．coli的谷氨醯胺合成酶調節中發現，該酶受8個最終產物的累積反饋抑制，只有當它們同時存在時，酶活力才被全部抑制（圖6-56）。如色氨酸單獨存在時，可抑制酶活力的16％，CTP相應為14％，氨基甲醯磷酸為13％，AMP為41％。這4種末端產物同時存在時，酶活力的抑製程度可這樣計算：色氨酸先抑制16％，剩下的84％又被CTP抑制掉11.8％（即84％×14％）；留下的72.7％活性中，又被氨基甲醯磷酸抑制掉9.4％（即72.2％×13％），還剩餘62.8％；這62.8％再被AMP抑制掉25.8％（即62.8×41％），最後只剩下原活力的37％。當8個產物同時存在時，酶活力才被全部抑制。

　　（5）順序反饋抑制（sequentialfeedbackinhibition） 如圖6-57所示，當E過多時，可抑制C→D，這時由於C的濃度過大而促使反應向F、G方向進行，結果又造成了另一末端產物G濃度的增高。由於G過多就抑制了C→F，結果造成C的濃度進一步增高。C過多又對A→B間的酶發生抑制，從而達到了反饋抑制的效果。這種通過逐步有順序的方式達到的調節，稱為順序反饋抑制（圖6-57）。這一現象最初是在研究枯草桿菌的芳香族氨基酸生物合成時發現的。

　　（二）反饋抑制的機制

　　從以上闡述中可以看出，儘管反饋抑制的類型極多，但其主要的作用方式在於最終產物對反應途徑中第一個酶即變構酶（allostericenzyme）或調整酶（regulatoryenzyme）的抑制。有關一些氨基酸或核苷酸等小分子末端產物對變構酶的作用機制，儘管還了解得不多，但目前普遍認為，它可用變構酶的理論來解釋。

　　這種理論認為，變構酶是一種變構蛋白，它具有兩個或兩個以上的立體專一性不同的接受部位，其中之一是能與底物結合併具有生化催化活性的部位，稱作活性中心，另一個部位是能與一個不能作底物的代謝產物——效應物（effector）相結合的變構部位，也稱調節中心。酶與效應物間的結合，可引起變構酶分子發生明顯而又可逆的結構變化，進而引起活性中心的性質發生改變。有的效應物能促進活性中心對底物的親和力，就被稱為活化劑，而有的效應物例如一系列反應途徑的末端產物，則會降低活性中心對底物的親和力，就被稱作抑製劑（圖6-58）。

　　變構酶在代謝調節中的功能，除了對同一合成途徑中的反饋抑制之外，還具有協調不同代謝途徑的功能。這是因為，變構酶除了能與它的專一底物和同一途徑代謝產物相結合外，還能與其他代謝途徑的產物相結合，從而受到該代謝途徑產物的活化或抑制。

　　總之，反饋抑制是極其重要的，其機制除變構酶和前述的同功酶外，還存在多種其他方式，這些都是有待進一步研究和闡明的問題。

二、酶合成的調節

　　酶合成的調節是一種通過調節酶的合成量進而調節代謝速率的調節機制，這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉錄水平上）的代謝調節。凡能促進酶生物合成的現象，稱為誘導（induction），而能阻礙酶生物合成的現象，則稱為阻遏（repression）。與上述調節酶活性的反饋抑制等相比，調節酶的合成（即產酶量）而實現代謝調節的方式是一類較間接而緩慢的調節方式，其優點則是通過阻止酶的過量合成，有利於節約生物合成的原料和能量。在正常代謝途徑中，酶活性調節和酶合成調節兩者是同時存在且密切配合、協調進行的。

　　（一）酶合成調節的類型

　　1．誘導根據酶的生成是否與環境中所存在的該酶底物或其有關物的關係，可把酶劃分成組成酶和誘導酶兩類。組成酶是細胞固有的酶類，其合成是在相應的基因控制下進行的，它不因分解底物或其結構類似物的存在而受影響，例如EMP途徑的有關酶類。誘導酶則是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶，例如E．coli在含乳糖培養基中所產生的β-半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。能促進誘導酶產生的物質稱為誘導物（inducer），它可以是該酶的底物，也可以是難以代謝的底物類似物或是底物的前體物質。例如，能誘導β-半乳糖苷酶除了其正常底物——乳糖外，不能被其利用的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，isopropy-lthiogalactoside）也可誘導，且其誘導效果要比乳糖高。例如，在E.coli培養基中，加入IPTG後，其β-半乳糖苷酶的活力可突然提高1000倍。若干比正常底物更有效的誘導物見表6-10。

　　酶的誘導合成又可分為兩種，其一稱同時誘導，即當誘導物加入後，微生物能同時或幾乎同時誘導幾種酶的合成，它主要存在於短的代謝途徑中。例如，將乳糖加入到E．coli培養基中後，即可同時誘導出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷轉乙醯酶的合成；另一則稱順序誘導，即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達到對較複雜代謝途徑的分段調節。

　　2．阻遏 在微生物的代謝過程中，當代謝途徑中某末端產物過量時，除可用前述的反饋抑制的方式來抑制該途徑中關鍵酶的活性以減少末端產物的生成外，還可通過阻遏作用來阻礙代謝途徑中包括關鍵酶在內的一系列酶的生物合成，從而更徹底地控制代謝和減少末端產物的合成。阻遏作用有利於生物體節省有限的養料和能量。阻遏的類型主要有末端代謝產物阻遏和分解代謝產物阻遏兩種。

　　（1）末端產物阻遏（end-productrepression） 指由某代謝途徑末端產物的過量累積而引起的阻遏。對直線式反應途徑來說，末端產物阻遏的情況較為簡單，即產物作用於代謝途徑中的各種酶，使之合成受阻遏，例如精氨酸的生物合成途徑（圖6-59）。

　　對分支代謝途徑來說，情況就較複雜。每種末端產物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點以前的「公共酶」僅受所有分支途徑末端產物的阻遏，此即稱多價阻遏作用（multivalentrepression）。也就是說，任何單獨一種末端產物的存在，都沒有影響，只有當所有末端產物都同時存在時，才能發揮出阻遏功能。在這方面，芳香族氨基酸、天冬氨酸族和丙酮酸族氨基酸的生物合成中的反饋阻遏，就是最典型的例子。

　　末端產物阻遏在代謝調節中有著重要的作用，它可保證細胞內各種物質維持適當的濃度。例如，在嘌呤、嘧啶和氨基酸的生物合成中，它們的有關酶類就受到末端產物阻遏的調節。

　　（2）分解代謝物阻遏（cataboliterepression） 指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。現在知道，分解代謝物的阻遏作用，並非由於快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。因此，分解代謝物的阻遏作用，就是指代謝反應鏈中，某些中間代謝物或末端代謝物的過量累積而阻遏代謝途徑中一些酶合成的現象。

　　例如，有人將E．coli培養在含乳糖和葡萄糖的培養基上，發現該菌可優先利用葡萄糖，並於葡萄糖耗盡後才開始利用乳糖，這就產生了在兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的「二次生長現象」（diauxie或bipha-sicgrowth）。其原因是，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。這一現象又稱葡萄糖效應。此外，用山梨醇或乙酸來代替上述乳糖時，也有類似的結果。由於這類現象在其他代謝中（例如銨離子的存在可阻遏微生物對精氨酸的利用等）的普遍存在，後來，人們索性把類似葡萄糖效應的阻遏統稱為分解代謝物阻遏。

　　（二）酶合成調節的機制

　　目前認為，由J．Monod和F．Jacob（1961）提出的操縱子假說可以較好地解釋酶合成的誘導和阻遏現象。在進行正式討論前，有必要對若干有關名詞先作一介紹。

　　（1）操縱子（operon） 指的是一組功能上相關的基因，它是由啟動基因（promoter）、操縱基因（operator）和結構基因（structuralgene）三部分組成。其中的啟動基因是一種能被依賴於DNA的RNA多聚酶所識別的鹼基順序，它既是RNA多聚酶的結合部位，也是轉錄的起始點；操縱基因是位於啟動基因和結構基因之間的一段鹼基順序，能與阻遏物（一種調節蛋白）相結合，以此來決定結構基因的轉錄是否能進行；結構基因則是決定某一多肽的DNA模板，可根據其上的鹼基順序轉錄出對應的mRNA，然後再可通過核糖體而轉譯出相應的酶。一個操縱子的轉錄，就合成了一個mRNA分子。

　　操縱子分兩類，一類是誘導型操縱子，只有當存在誘導物（一種效應物）時，其轉錄頻率才最高，並隨之轉譯出大量誘導酶，出現誘導現象，例如乳糖、半乳糖和阿拉伯糖分解代謝的操縱子等；另一類是阻遏型操縱子，只有當缺乏輔阻遏物（一種效應物）時，其轉錄頻率才最高。由阻遏型操縱子所編碼的酶的合成，只有通過去阻遏作用才能起動，例如精氨酸、組氨酸和色氨酸合成代謝的操縱子等。

　　（2）調節基因（regulatorgene） 用於編碼組成型調節蛋白的基因。調節基因一般位於相應操縱子的附近。

　　（3）效應物（effector） 是一類低分子量的信號物質（如糖類及其衍生物、氨基酸和核苷酸等），包括誘導物（inducer）和輔阻遏物（corepressor）兩種，它們可與調節蛋白相結合以使後者發生變構作用，並進一步提高或降低與操縱基因的結合能力。

　　（4）調節蛋白（regulatoryprotein） 是一類變構蛋白，它有兩個特殊位點，其一可與操縱基因結合，另一位點則可與效應物相結合。當調節蛋白與效應物結合後，就發生變構作用。有的調節蛋白在其變構後可提高與操縱基因的結合能力，有的則會降低其結合能力。

　　調節蛋白可分兩種，其一稱阻遏物（repressor），它能在沒有誘導物（效應物的一種）時與操縱基因相結合；另一則稱阻遏物蛋白（aporepressor），它只能在輔阻遏物（效應物的另一種）存在時才能與操縱基因相結合。

　　1．乳糖操縱子的誘導機制 E．coli乳糖操縱子（lac）由lac啟動基因、lac操縱基因和三個結構基因所組成。三個結構基因分別編碼β-半乳糖苷酶、滲透酶和轉乙醯基酶（圖6-60）。乳糖操縱子是負調節（negativecontrol）的代表，因在缺乏乳糖等誘導物時，其調節蛋白（即lac阻遏物）一直結合在操縱基因上，抑制著結構基因上轉錄的進行。當有誘導物——乳糖存在時，乳糖與lac阻遏物相結合，後者發生構象變化，結果降低了lac阻遏物與操縱基因間的親和力，使它不能繼續結合在操縱子上。操縱子的「開關」打開後，轉錄、轉譯就可順利進行了。當誘導物耗盡後，lac阻遏物可再次與操縱基因相結合，這時轉錄的「開關」被關閉，酶就無法合成，同時，細胞內已轉錄好的mRNA也迅速地被核酸內切酶所水解，所以細胞內酶的合成速度急劇下降。如果通過誘變方法使之發生lac阻遏物缺陷突變，就可獲得解除調節即在無誘導物時也能合成β-半乳糖苷誘導酶的突變株。

　　從圖6-60中還可看到，lac操縱子還受到另一種調節即正調節（positivecontrol）的控制。這就是當第二種調節蛋白CRP（CAMP受體蛋白）或CAP（降解物激活蛋白）直接與啟動基因結合時，RNA多聚酶才能連接到DNA鏈上而開始轉錄。CRP與CAMP（環化AMP）的相互作用，會提高CRP與啟動基因的親和性。葡萄糖會抑制cAMP的形成，從而阻遏了lac操縱子的轉錄。

　　2．色氨酸操縱子的末端產物阻遏機制 色氨酸操縱子的阻遏是對合成代謝酶類進行正調節的例子。在合成代謝中，催化氨基酸等小分子末端產物合成的酶應隨時存在於細胞內，因此，在細胞內這些酶的合成應經常處於消阻遏狀態；相反，在分解代謝中的β-半乳糖苷酶等則須經常處於阻遏狀態。

　　E．coli色氨酸操縱子也是由啟動基因、操縱基因和結構基因三部分組成的。啟動基因位於操縱子的開始處；結構基因上有5個基因，分別為「分支酸→鄰氨基苯甲酸→磷酸核糖鄰氨基苯甲酸→羧苯氨基脫氧核糖磷酸→吲哚甘油磷酸→色氨酸」途徑中的5種酶編碼。其調節基因（trpR）遠離操縱基因，編碼一種稱作阻遏物蛋白的效應物蛋白。當存在色氨酸時，它起著輔阻遏物的作用，因與阻遏物蛋白有極高的親和力，故兩者間形成了一個完全阻遏物（holorepressor），由這種完全阻遏物來阻止結構基因的轉錄。反之，當降低色氨酸濃度時，就會導致這一完全阻遏物的解離，並脫離操縱基因，使操縱基因的「開關」打開，因此結構基因的mRNA又可正常合成。所以，色氨酸操縱子的末端產物阻遏是一種正調節（圖6-61）。

　　從圖6-61中可以看出，在沒有末端產物的情況下，阻遏物蛋白不能與輔阻遏物（如色氨酸）結合成完全阻遏物，因此操縱基因的「開關」是打開的，這時轉錄、轉譯可正常進行，誘導酶大量合成；反之，則阻遏物蛋白可與輔阻遏物結合成一個有活性的完全阻遏物，它與操縱基因相結合，使轉錄的「開關」關閉，從而無法進行轉錄和轉譯。

三、代謝調控在發酵工業中的應用

　　在發酵工業中，控制微生物生理狀態以達到高產的環境條件很多，如營養物類型和濃度，氧的供應，pH的調節和表面活性劑的存在等。這裡要討論的則是另一類方式，即如何控制微生物的正常代謝調節機制，使其累積更多為人們所需要的有用代謝產物。由於一些抗生素等次生代謝產物的代謝調控十分複雜且目前還不夠清楚，因此，下面所舉的例子都是一些小分子主流代謝產物。現分三方面來介紹。

　　（一）應用營養缺陷型菌株以解除正常的反饋調節

　　在直線式的合成途徑中，營養缺陷型突變株只能累積中間代謝物而不能累積最終代謝物。但在分支代謝途徑中，通過解除某種反饋調節，就可以使某一分支途徑的末端產物得到累積。

　　1．賴氨酸發酵 如圖6-62所示，在許多微生物中，可用天冬氨酸為原料，通過分支代謝途徑合成出賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。賴氨酸是一種重要的必需氨基酸，在食品、醫藥和畜牧業上需要量很大。但在代謝過程中，一方面由於賴氨酸對天冬氨酸激酶（AK）有反饋抑制作用，另一方面由於天冬氨酸除用於合成賴氨酸外，還要作為合成甲硫氨酸和蘇氨酸的原料，因此，在正常的細胞內，就難以累積較高濃度的賴氨酸。

　　為了解除正常的代謝調節以獲得賴氨酸的高產菌株，工業上選育了Corynebacteriumglutami-cum（谷氨酸棒桿菌）的高絲氨酸缺陷型菌株作為賴氨酸的發酵菌種。這個菌種由於不能合成高絲氨酸脫氫酶（HSDH），故不能合成高絲氨酸，也不能產生蘇氨酸和甲硫氨酸，在補給適量高絲氨酸（或蘇氨酸和甲硫氨酸）的條件下，在含有較高糖分和銨鹽的培養基上，能產生大量的賴氨酸。

　　2．肌苷酸（IMP）的生產肌苷酸是重要的呈味核苷酸，它是嘌呤核苷酸生物合成過程中的一個中間代謝物。只有選育一個發生在IMP轉化為AMP或GMP的幾步反應中的營養缺陷型菌株，才可能累積IMP。C．glutamicum的IMP合成途徑及其代謝調節機制可見圖6-63。從圖中可以看出，該菌的一個腺苷酸琥珀酸合成酶（酶12）缺失的腺嘌呤缺陷型，如果在其培養基中補充少量AMP就可正常生長並累積IMP。當然，假如補充量太大，反而會引起對酶2的反饋抑制。

　　（二）應用抗反饋調節的突變株解除反饋調節

　　抗反饋調節突變菌株，就是指一種對反饋抑制不敏感或對阻遏有抗性的組成型菌株，或兼而有之的菌株。在這類菌株中，因其反饋抑制或阻遏已解除，或是反饋抑制和阻遏已同時解除，所以能分泌大量的末端代謝產物。有關抗反饋調節菌株的特性和選育方法可見第七章第五節和第八章第二節。

　　例如，當把Corynebacteriumcrenatum（鈍齒棒桿菌）培養在含蘇氨酸和異亮氨酸的結構類似物AHV（α-氨基-β-羥基戊酸）的培養基上時，由於AHV可干擾該菌的高絲氨酸脫氫酶、蘇氨酸脫氫酶以及二羧酸脫水酶，所以抑制了該菌的正常生長。如果採用誘變（如用亞硝基胍作為誘變劑）後所獲得的抗AHV突變株進行發酵，就能分泌較多的蘇氨酸和異亮氨酸。這是因為，該突變株的高絲氨酸脫氫酶或蘇氨酸脫氫酶和二羧酸脫水酶的結構基因發生了突變，故不再受蘇氨酸或異亮氨酸的反饋抑制，於是就有大量的蘇氨酸和異亮氨酸的累積。如進一步再選育出甲硫氨酸缺陷型菌株，則其蘇氨酸產量還可進一步提高，原因是甲硫氨酸合成途徑上的兩個反饋阻遏也被解除了（參看圖6-52）。

　　（三）控制細胞膜的滲透性

　　微生物的細胞膜對於細胞內外物質的運輸具有高度選擇性。細胞內的代謝產物常常以很高的濃度累積著，並自然地通過反饋阻遏限制了它們的進一步合成。採取生理學或遺傳學方法，可以改變細胞膜的透性，使細胞內的代謝產物迅速滲漏到細胞外。這種解除末端產物反饋抑制作用的菌株，可以提高發酵產物的產量。

　　1．通過生理學手段控制細胞膜的滲透性 在谷氨酸發酵生產中，生物素的濃度對谷氨酸的累積有著明顯的影響，只有把生物素的濃度控制在亞適量情況下，才能分泌出大量的谷氨酸（表6-11）。

　　生物素影響細胞膜滲透性的原因，是由於它是脂肪酸生物合成中乙醯CoA羧化酶的輔基，此酶可催化乙醯CoA的羧化並生成丙二酸單醯輔酶A，進而合成細胞膜磷脂的主要成分——脂肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改變細胞膜的成分，進而改變膜的透性和影響谷氨酸的分泌。

　　當培養液內生物素含量很高時，只要添加適量的青黴素也有提高谷氨酸產量的效果。其原因是青黴素可抑制細菌細胞壁肽聚糖合成中轉肽酶的活性（見本章第三節），結果引起其結構中肽橋間無法進行交聯，造成細胞壁的缺損。這種細胞的細胞膜在細胞膨壓的作用下，有利於代謝產物的外滲，並因此降低了谷氨酸的反饋抑制和提高了產量。

　　2．通過細胞膜缺損突變而控制其滲透性 應用谷氨酸產生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培養基中，也能因細胞膜發生滲漏而提高谷氨酸的產量。這是因為油酸是一種含有一個雙鍵的不飽和脂肪酸（十八碳烯酸），它是細菌細胞膜磷脂中的重要脂肪酸。油酸缺陷型突變株因其不能合成油酸而使細胞膜缺損。

　　另一種可以利用石油發酵產生谷氨酸的Corynebacteriumhydrocarbolastus（解烴棒桿菌）的甘油缺陷型突變株，由於缺乏a-磷酸甘油脫氫酶，故無法合成甘油和磷脂。其細胞內的磷脂含量不到親株含量的一半，但當供應適量甘油（200μg/ml）時，菌體即能合成大量谷氨酸（72g/L），且不受高濃度生物素或油酸的干擾。

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