腫瘤標誌物檢測與臨床應用

近年來，腫瘤相關檢測技術的研究通常包括蛋白類和糖類抗原腫瘤標誌物(tumor marker)、循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell ，CTC）、血液遊離DNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、外泌體和組織細胞腫瘤標誌物等。

腫瘤標誌物是指存在於腫瘤細胞內或腫瘤細胞表面脫落的物質，或者是宿主對體內腫瘤反應而產生的物質。其存在於細胞胞質、胞核中或細胞表面，也可見於血液、其他體液或組織中。這些物質存在可證實腫瘤存在，分析病程、監測療效和複發以及判斷預後。

目前常規用於臨床的主要是血清(血漿)蛋白和糖類抗原腫瘤標誌物。這些腫瘤標誌物實際上是與腫瘤相關的抗原，屬於腫瘤相關標誌物，大致可分為:

1.胚胎抗原胚胎期表達，正常成年人不表達，伴隨腫瘤發生重新表達的抗原，如AFP和CEA。

2.腫瘤發生導致細胞膜蛋白翻譯後修飾(如糖基化等)異常所形成的抗原，如CA50、CA19-9、CA72-4、CA15-3、CA125，SCC等。

3.激素肽、酶及蛋白類抗原正常組織中有表達，但在腫瘤組織中過量表達，腫瘤細胞分裂及破潰時排出的抗原。激素類抗原有HCG、GH、PTH和ACTH等;酶類抗原有PSA和NSE等;蛋白類抗原有自2-MG、TPA和CYFRA21-1等。

理想腫瘤標誌物的標準:①其在正常人體內無表達，一旦微小腫瘤出現便具有足夠量可從體液中被檢出，具有高度敏感性，能早期測出所有腫瘤患者;②特異性好，鑒別腫瘤和非腫瘤患者應100%準確;③有器官特異性，不同類型腫瘤應表達對其特異的腫瘤標誌物，能對腫瘤進行準確定位;④體液中腫瘤標誌物濃度應與瘤體大小、臨床分期相關，可用於判斷預後;⑤腫瘤標誌物的半衰期應短，能反映體內腫瘤的動態變化，監測治療效果、複發和轉移。但由於腫瘤發生、發展的原因至今尚未完全明了，預示腫瘤發生的標誌物亦不明確，所以還尚未發現理想的腫瘤標誌物。

《醫》：您經手的腫瘤檢測案例很多。能不能從您的經驗方面，談一談在不同類型肺癌診斷中，哪些相關腫瘤標誌物檢測價值最優？

陳建魁：

肺癌是癌症導致死亡的最主要原因,占癌症死亡總數的23%?肺癌主要分兩大類,非小細胞肺癌(NSCLC)約佔80%,小細胞肺癌(SCLC) 約佔20%?NSCLC 可進一步分為腺癌?鱗癌?大細胞肺癌?支氣管肺泡癌?

美國臨床生化委員會和歐洲腫瘤標誌物專家組推薦常用的原發性肺癌標誌物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）、細胞角蛋白片段19（cytokeratin fragment, CYFRA21-I）、胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin releasing peptide, ProGRP）和鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCC）等。

肺癌的輔助診斷和療效觀察：①小細胞肺癌（SCLC）：NSE和ProGRP是SCLC特異性較高的腫瘤標誌物。②非小細胞肺癌（NSCLC）：血清CEA、SCC和CYFRA21-1水平的升高有助於NSCLC的診斷和療效觀察。SCC和CYFRA21-1一般認為其對肺鱗癌有較高的特異性。若將NSE、CYFRA21-1、ProGRP、CEA和SCC等指標聯合檢測，可提高鑒別SCLC和NSCLC的準確率。

隨訪觀察：建議患者在治療開始後1-3年內，應每3個月檢測1次腫瘤標誌物；3-5年內每半年1次；5年以後每年1次。隨訪中若發現腫瘤標誌物明顯升高（超過25%），應在1個月內複測1次，如果仍然升高，則提示可能複發或存在轉移。NSE和ProGRP對SCLC的複發有較好的預測價值，超過50%的患者複發時NSE和ProGRP水平升高；對於NSCLC患者，術後CEA水平仍升高提示預後不良，應密切隨訪。

《醫》：循環micro Rna-122a在肝癌診斷中的表達水平如何？

陳建魁：

原發性肝細胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，我國是受肝癌威脅最大的國家，發病率和死亡率約佔全球的50%。

miR-122a定位於人染色體的18q21.31，是肝臟特異性高表達miRNA，約佔成年個體肝臟總miRNAs的70%，每個肝細胞表達量達66000拷貝以上，參與肝細胞分化、增殖、凋亡等眾多生物學過程，有研究發現miR-122a在70%肝癌組織和肝癌來源的細胞系中表達下調，並證實miR-122a在肝癌的發生髮展過程中有重要作用。王閣課題組利用miRNA晶元技術篩選肝癌細胞HepG2和正常肝上皮細胞LO2中miRNAs的差異表達譜，發現在HepG2細胞中miR-122a呈低表達，生物信息學分析發現miR-122a的靶基因有1104個，涉及細胞周期、信號轉導、細胞增殖、分化和細胞凋亡等生物學過程。過表達miR-122a可增加肝癌細胞的放療敏感性，其具體機制可能通過下調直接作用靶基因cyclin G1，使細胞周期阻滯於G2/M期，這種調節作用與p53基因表達狀態相關。

《醫》：HE4 在卵巢癌管理中的價值體現？

陳建魁：

人附睾蛋白4（HE4）最早是在人附睾上皮細胞中發現的，定位於染色體20q12～13.1 上，全長約12 kb，是附睾特有的、與精子成熟有關的蛋白質。HE4 在女性宮頸腺體、子宮內膜腺體、輸卵管和巴氏腺組織呈高表達，在正常的卵巢上皮細胞中不表達，但在卵巢漿液性癌及卵巢子宮內膜樣癌細胞中高表達，此外，在子宮內膜癌細胞中也可檢測到HE4。HE4 可作為診斷卵巢癌的一種新型血清標誌物，可用於卵巢癌的早期診斷。由於HE4 在肺癌中也有表達，非小細胞肺癌、小細胞肺癌HE4 均可異常升高，提示在用血HE4 鑒別診斷婦科疾病時，應排除肺癌的干擾。

HE4 在卵巢癌診斷及監測中的應用 Moore 等對1042 例良性疾病患者研究顯示，婦科良性疾病總體HE4、CA125 升高率分別是8%和29%（P＜0.001）。即婦科良性疾病患者血清HE4 很少升高，而CA125 升高者較多，這在絕經前患者中表現尤為明顯。Holcomb 等研究發現，CA125 和HE4 對上皮性卵巢癌（EOC）的敏感度分別是83.3%和88.9%，特異度分別是59.5%和91.8%；在鑒別絕經前婦女附件包塊良惡性方面，相對CA125 而言，血清HE4 對卵巢癌的特異度更高。

HE4 在鑒別卵巢癌與卵巢子宮內膜異位症（EMs）中的應用 EMs 是最常見的婦科良性疾病，80%的EMs 發生在卵巢。EMs 可增加某些類型卵巢癌（如卵巢子宮內膜樣癌和透明細胞癌）的發病風險。研究發現，卵巢EMs 及晚期非卵巢EMs 血清CA125 水平高於健康對照組，且濃度隨著EMs 分期的增加而升高；而HE4 水平在EMs 組和對照組都無顯著變化。超聲診斷卵巢包塊同時伴有血清HE4、CA125 水平升高，提示存在卵巢癌的可能；若只有CA125 升高則考慮EMs 或其他良性疾病；若只有HE4升高則可能是卵巢癌或子宮內膜癌等惡性腫瘤。

總之，HE4 鑒別絕經前婦女附件包塊性質的特異度比CA125 高；單用HE4 或HE4 與CA125 聯合檢測不但有助於對卵巢良惡性腫瘤的鑒別以及發現早期卵巢癌，而且HE4 也是監測卵巢癌術後治療效果以及預測是否複發的重要指標。HE4 在子宮內膜癌各期表達均升高，且在子宮內膜癌早期血清HE4 敏感度比CA125 高；HE4 與子宮內膜癌浸潤肌層的深度相關，可在術前幫助臨床醫生決定實施手術的範圍。

《醫》：很多時候腫瘤標誌物升高可能是多方面原因導致的，也就是說目前的腫瘤標誌物的特異性和敏感性還很難幫助確診，一直是檢驗科很尷尬的問題。您對此如何看待？

陳建魁：

(一) 應正確認識腫瘤標誌物在腫瘤篩查和治療監測中的作用

腫瘤標誌物對腫瘤的早期診斷具有積極意義，但必須充分認識到腫瘤標誌物在腫瘤早期篩查中的局限性，現有腫瘤標誌物在敏感性和特異性兩方面都無法滿足早期診斷要求。

理論上，腫瘤標誌物可以發現亞臨床期的腫瘤，但因腫瘤生物學特性，在其未突破基膜、侵犯粘膜層之前(原位癌)，其抗原尚未進入血液循環，即便有少量逸入血中，現有方法學的檢測敏感性也無法將其檢測出來;另一方面，真正腫瘤特異的標誌物極少，因此，即使腫瘤標誌物陽性，也無法斷定是腫瘤所致，即使如PSA，雖然具有較高器宮特異性但也不具腫瘤特異性，許多良性前列腺疾病也會升高。

目前，學術界對腫瘤標誌物臨床應用的基本共識是:腫瘤標誌物的臨床應用價值主要是對療效判斷和複發監測。治療後腫瘤標誌物濃度變化，常有三種情況:①腫瘤標誌物濃度下降到參考範圍，提示腫瘤治療有效;②腫瘤標誌物濃度下降但仍持續在參考範圍以上，提示有腫瘤殘留和(或)腫瘤轉移;③腫瘤標誌物濃度下降到參考範圍一段時間後，又重新升高，提示腫瘤複發或轉移。

(二) 應選擇最佳的腫瘤標誌物組合

由於現有腫瘤標誌物生物學特性的限制，單獨檢測一種腫瘤標誌物存在陽性率不高、特異性不強等問題。如聯合檢測腫瘤標誌物，可提高陽性率及特異性;另外，為了確定何種腫瘤標誌物可作為治療後的隨訪監測指標，也需進行多項腫瘤標誌物的聯合檢測，以便篩選。但聯合檢測的指標必須經科學分析、嚴格篩選，合理選擇幾項敏感性、特異性能夠互補的腫瘤標誌物構成最佳組合。

(三) 應建立腫瘤標誌物測定的質量保證體系

當前，在人們普遍談"癌"色變的情形下，腫瘤標誌物就成為一類十分特殊的檢驗項目，其結果直接關係到受檢者的心理和生存狀態。正確的結果可以讓患者受益，而錯誤的結果或是讓人虛驚一場(假陽性)，或是延誤病情(假陰性)，嚴重的還可引發醫療糾紛甚至造成醫療事故。因此，臨床實驗室應採取各種有效措施建立完善的質量保證體系，力求檢測結果的準確與穩定。

腫瘤標誌物的質量保證體系包括分析前、分析中和分析後三個不同階段，每個階段都有相應的質量要求。

1.分析前的質量要求研究表明，分析前誤差是整個分析誤差的主要來源，同時也是實驗室最難控制的誤差來源。分析前誤差主要有以下幾個方面:

（1）生物學變異:包括年齡、性別、生理周期甚至種族等造成的個體間差異。

1)年齡:年齡對腫瘤標誌物有顯著影響，一些腫瘤標誌物如糖類抗原、CEA、AFP、PSA等隨年齡增長而升高，ALP、Fer在不同的年齡段參考值也不相同。

2)性別:有些腫瘤標誌物如激素類、CK，Fer等因性別而異。

3)生理周期:婦女在月經期和妊娠期CA125 及CA19-9可升高，妊娠期AFP明顯升高，皮質醇有晝夜節律的變化等。

(2)標本採集過程:包括標本類別、采血時患者狀態等。

1)標本類別:血清和血漿適用於大多數腫瘤標誌物檢測，但有些項目不能用EDTA抗凝，而促凝劑對某些指標也會有干擾。

2)患者狀態:一些治療如前列腺按摩、前列腺穿刺、導尿及直腸鏡檢查後，患者血液中PSA和前列腺酸性磷酸酶可升高;一些藥物也會影響腫瘤標誌物的測定，如抗雄激素治療前列腺癌則抑制PSA產生，而絲裂黴素、順鉑等抗腫瘤藥物可導致PSA假陽性;化療會導致一些腫瘤標誌物一過性升高;吸煙會使CEA輕度升高。

(3)標本處理過程:包括放置離心時間、溶血等。

1)酶類和激素類腫瘤標誌物不穩定:如fPSA和HCG，半衰期短，易降解，應及時測定。不能及時測定的標本，應低溫(-20℃)保存並防止反覆凍融。

2)溶血對許多指標有影響:如溶血可導致 NSE、LDH等假性升高，而嚴重溶血甚至會干擾測定而無法得出結果。

2.分析中的質量要求目前，各個臨床實驗室使用的腫瘤標誌物檢測方法各不相同，加之缺乏可靠的通用標準品進行校正，使得各個實驗室的結果缺乏可比性。在這種情形下，保證各個實驗室檢測的穩定性成為當務之急。

(1)分析方法與分析過程的質量要求

1)分析方法要求:應選擇業界公認或通過權威認證的方法，如FDA認證、CE認證等，明確所用方法的檢測限、可報告範圍、干擾因素等，並保證批內、批間的檢測精密度符合要求。

2)建立完善的室內質控體系:①採用第三方來源的人基質質控品;②多點質控，涵蓋各個醫學決定水平;③多規則質控判讀，如應用Westgard規則判讀質控數據，以保證質控過程的可靠性。

3)積极參加室間質評:通過室間質評可以及時發現檢測體系存在的系統誤差並加以糾正。

(2)影響腫瘤標誌物檢測的干擾因素

1)交叉反應:某些腫瘤標誌物有多種亞型，了解其交叉反應有助於對檢驗結果準確性的判斷。

2)鉤狀效應:腫瘤標誌物的濃度範圍跨度大， 有的會跨越幾個數量級，出現"鉤狀效應"的機會很多，審定結果時應結合病史及歷史數據進行綜合分析，以避免假性偏低結果的報出。

3)攜帶污染:全自動發光免疫分析儀一般都採用一次性耗材(吸頭、反應杯等)，杜絕了攜帶污染。而一些半自動分析方法如ELISA法、放免法等發生攜帶污染的機會就比較多。應對檢測系統進行攜帶污染評估，做到心中有數。

4)嗜異性抗體:此類抗體能與檢測試劑發生反應導致結果異常，出現假陽性。

3.分析後的質量要求應結合臨床資料對檢測數據進行分析審核並及時反饋臨床。

《醫》：腫瘤檢測項目一直是這些項目，有沒有可能未來再多些新項目，敏感度更好、特異性更強？您對未來的腫瘤檢測技術是如何預測的？

近年來，關於腫瘤細胞和腫瘤標誌物的相關研究取得了極大的進展，包括循環腫瘤細胞、血液遊離DNA、微小RNA、外泌體和組織細胞腫瘤標誌物等，相對於傳統的血清學標誌物，這些新指標的敏感度更好、特異性更高，對臨床醫師的指導作用更強。現分別簡要介紹如下：

1 循環腫瘤細胞

循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell ，CTC）是自發或因診療操作原因由原發病灶脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞。腫瘤細胞在機體內通常以休眠模式存在，當機體受到內外界環境刺激時，微小病灶被激活並增殖，病變細胞穿過脈管基底膜，進入新的組織，並定植增殖。進入外周血中的CTC能否形成遠端轉移灶與腫瘤的微環境和腫瘤細胞本身的基因表達譜有關。有些CTC被免疫系統識別攻擊，發生凋亡；有些則能夠存活下來，形成轉移。部分已獲得高侵襲性表型的腫瘤細胞，從原發灶脫落後進入外周血循環，進入繼發臟器的局部微環境，可逃脫免疫監視並克隆增殖，成為肉眼可見的腫瘤病灶。CTC的存在表明腫瘤細胞已經完成了從原發病灶脫落並進入血液循環的過程。因此，CTC的檢測可以看做是一種對實體腫瘤的「液體活檢」，這種檢測技術因其實時、無創等特點，為腫瘤患者的實時監測提供了新的選擇。臨床研究表明，CTC數目的變化有可能成為監測早期轉移和評價治療效果的指標，目前已在乳腺癌、肺癌和結直腸癌中廣泛應用,能夠為臨床進展和預後等提供極具價值的判斷依據。

需要注意的是，固然CTC檢測具有評估疾病進程和預測腫瘤轉移複發、預後的潛能, 但是CTC也是具有高度異質性的細胞群體,檢測少數更具存活力和侵襲性的CTC比單獨CTC計數可能更有價值。一項臨床研究發現,在小部分乳腺癌患者(11%)原發腫瘤組織檢測HER-2陰性, 卻可以從相同患者CTCs中檢測到HER-2陽性, 在使用曲妥珠單抗治療後, 部分患者有效，說明檢測CTCs表達HER-2優於檢測原發腫瘤組織。CTC常常發生上皮-間質轉化( epithelial-mesenchymal transition，EMT)，在獲得腫瘤細胞侵襲性的同時逐漸失去了上皮細胞的粘附性，容易發生漏檢，在實際工作中，應予注意。

現將CTC的篩選和富集技術和檢測和鑒定方法簡述如下：

1） CTC的篩選和富集

CTC在人體內含量極少，正常人血液中含有白細胞（3.5～9.5）×106/ml，紅細胞（3.8～5.8）×109/ml，而CTC含量可能僅為1～2個/ml。所以采血後首先要進行CTC的富集之後才能檢測。目前所用的富集方法分為下面幾類：

密度梯度離心法：密度梯度離心法利用血液中各種細胞密度的不同、離心後可分層的特點，將CTC與血液中的粒細胞、紅細胞等分離。此類方法價格低廉，操作簡便，離心後可保留CTC的活力，但由於外周血中單核細胞密度與CTC相似，難以完全分離，致其特異性不高；且血液標本採集不當形成的凝塊會改變腫瘤細胞密度，影響分離效果,現使用不多。

利用細胞大小分離：用直徑為8μm的濾膜過濾經過固定處理的外周血液，因上皮腫瘤細胞比一般血細胞體積大，過濾後可保留在濾膜上。Lee等使用此方法過濾MCF-7乳腺癌細胞系，平均捕獲率達到了61%。此方法簡單，不依靠腫瘤特異性抗原或分子，各種腫瘤均適用，且細胞形態保存完整，表面的抗原或分子標誌物均無破壞，可供進一步形態學檢查和分子（細胞）生物學檢測。但少數生長不好或萎縮凋亡的CTC因其直徑小於8μm而無法被濾膜截留，形成假陰性；有些體積超過8μm的大白細胞也可被濾膜截留，造成假陽性。

免疫磁珠富集技術：從外周血中篩選出帶有腫瘤相關抗原（如：EpCAM）的腫瘤細胞。細胞表面該抗原與包被抗EpCAM抗體磁珠的特異性抗體結合，形成抗原-抗體-免疫磁珠複合物，使含有靶抗原的目的CTC與其他細胞分離，從而達到特異性分離的目的。因所使用的磁珠為納米級（10nm-100nm），故檢測過程不會引起細胞損傷。此方法特異性高，細胞形態保存完整，降低了後續鑒定工作中的干擾因素，且CTC抗原可以有多個靶位，能提高檢出率。FDA批准的Cell search檢測平台即使用此種方法。

此外，體外微管技術、晶元富集技術、納米結構技術等也可用於CTC的富集。

2）循環腫瘤細胞的檢測和鑒定

免疫磁珠法：該方法使用上皮細胞特異性EpCAM抗體包被磁珠，對上皮細胞進行富集。細胞經固定後，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染料標記細胞核，用抗CD45和CK8、CK18、CK19熒光抗體染色細胞，並用四色熒光顯微鏡進行分析：將EpCAM+ CK+ DAPI+ CD45-的細胞定義為CTC。

免疫斑點技術：該技術檢測有活力和分泌功能的CTC。將細胞培養在包被特異性EpCAM抗體和抗CD45抗體的板條上並孵育48h，細胞分泌的蛋白與板條底部的相應抗體結合，通過洗板去除細胞，加入熒光抗體，板膜上留下的每一個點即一個細胞分泌的蛋白，用儀器進行掃描後可統計分析結果。

微流體晶元技術（CTC-Chip）：在微流體晶元上包被腫瘤特異性抗體，當血液樣本流過晶元時，腫瘤細胞會因抗原抗體反應而黏附在晶元上。通常陽性選擇標誌物是CK和DAPI，陰性選擇標誌物為CD45。Nagrath在外周血中對116例轉移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和大腸癌的患者檢測，有115例顯示陽性。此法靈敏度極高，且能夠實時監測，但由於需要精確的控制層流條件，且價格昂貴，目前僅用於實驗研究。

此外，聚合酶鏈反應（PCR/RT-PCR）、流式細胞術（FCM）、原位檢測平台技術、CTC控制器等技術也可用於循環腫瘤細胞的檢測和鑒定。

2、血液遊離腫瘤細胞DNA

遊離DNA是一種無細胞狀態的胞外DNA,主要是由單鏈或雙鏈DNA組成, 以DNA-蛋白質複合物或遊離DNA兩種形式存在。 CTC及轉移灶中的腫瘤細胞也會因為壞死和凋亡向外周血釋放DNA,形成循環遊離腫瘤細胞DNA。腫瘤患者中循環腫瘤細胞DNA只是循環遊離DNA的一部分, 其他非腫瘤細胞在壞死和凋亡時也可以向外周血釋放DNA形成循環遊離DNA。研究發現腫瘤患者循環中遊離DNA的水平通常要高於健康個體, 並且遊離DNA表現出與腫瘤組織相同的生物學特性, 說明腫瘤患者中循環腫瘤細胞DNA是循環遊離DNA的主要來源。 目前, 關於惡性腫瘤患者循環腫瘤細胞DNA的來源及其發生機制有以下3種觀點: (1)實體腫瘤細胞在生長過程中能持續自發釋放腫瘤細胞DNA進入外周血液, 成為循環血DNA的主要來源; (2)循環中腫瘤細胞或微轉移灶的裂解; (3)腫瘤細胞的壞死或凋亡。通過對胃腸腫瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸腫瘤、泌尿系統腫瘤、婦科腫瘤和皮膚癌等多種腫瘤的研究, 遊離循環腫瘤細胞DNA的檢測被認為是一個潛在的腫瘤早期診斷和預後判斷的有力手段。

3、外泌體(exosome)

外泌體(exosome) 是一種存在於細胞外的多囊泡體,可通過細胞內吞胞膜向內凹陷形成多泡內涵體,內涵體與細胞膜融合後釋放其中的小囊泡?外泌體的直徑為40～110 nm,包含RNA?蛋白質?microRNA?DNA 片段等多種成分,在血液、唾液?尿液?腦脊液和母乳等多種體液中均有分布。外泌體是具有功能活性並可進行細胞間信息傳遞的分泌微囊泡。外泌體可通過改變腫瘤的微環境,釋放自身攜帶的細胞因子等多種方式促進腫瘤的發生?增殖?遷移?使腫瘤產生抗性,給腫瘤的治療帶來障礙。因其含有腫瘤細胞所分泌的特異性成分,因而可通過對外泌體中相關分子改變的檢測,對疾病進行診斷和監測,並可為臨床個體化用藥提供依據?

4、微小RNA microRNA

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類參與基因轉錄後水平調控的非編碼小分子RNA, 其長度為18～25個核苷酸(nt)，由一段具有髮夾樣環狀結構、長約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經Dicer酶加工後生成，miRNA的主要生物學功能包括促進機體組織和器官生長與發育,調控細胞增殖?分化及凋亡,參與代謝和應激反應等，在腫瘤發生過程中也發揮重要的調控作用?目前已知人類約有50% 已注釋miRNA位於與癌症相關的染色體脆性位點及基因組區域中,其突變或者異位表達與多種人類腫瘤相關，miRNAs 具有腫瘤抑制基因或者癌基因的功能，不同腫瘤miRNAs 表達譜不同，miRNAs 的表達水平可較mRNA 更準確地區分正常組織或腫瘤組織的類型，其表達水平與腫瘤的臨床病理分型及預後密切相關。因此，血清miRNA檢測在惡性腫瘤的臨床應用中越來越受關注,尤其在惡性腫瘤早期診斷?療效預測、確定治療靶點及預後評估等方面,miRNA正發揮著越來越大的作用。

血清微小RNA的檢測方法,按技術原理可將其主要分為2大類:①核酸雜交技術：如Northern Blotting?微陣列技術或基因晶元技術等? ②核酸擴增技術：如實時熒光定量PCR?新一代基因測序技術等?實時熒光定量PCR靈敏度高且特異性好,是目前測定血清miRNA最常用的方法?新一代基因測序技術可通過其大量的平行測序,發現並定量出全基因組水平的miRNA圖譜,但該方法對設備要求高、費用昂貴?

近年多項研究證實，miRNAs表達失調與多種腫瘤相關，腫瘤患者miRNA 譜往往呈異常表達狀態,籍此可用於腫瘤的診斷、治療效果監測和預後判斷等。比如，肺癌病理類型不同,對於準確制定肺癌治療方案也有非常重要的意義,但現階段肺癌的檢測手段區分各病理類型的敏感性和特異性較差；而Hamamoto等研究顯示,miR-196b,miR-205和miR-37能夠準確地區分肺腺癌和肺鱗癌?

在某些類型的腫瘤中,循環miRNA 的表達水平與其疾病狀態密切相關,瀰漫大B 細胞淋巴瘤患者血液中miRNA-155,miRNA-210 和mRNA-21 的表達水平顯著增高；胃癌患者血清中miRNA-18a家族表達水平明顯升高；卵巢癌患者血清中miRNA-21?mRNA-92和mRNA-93 的表達水平顯著增高?在結腸癌中,過表達miRNA-141 的患者TNM 分期較高,並且更易發生肝轉移,而過表達miRNA-221 的患者更易發生淋巴結轉移以及腫瘤複發?在經過治療後,腫瘤患者體內循環miRNA 異常的表達水平則會發生一定的變化,比如結腸癌患者血清中miRNA-17-3p 和miRNA-92 術後較術前明顯降低；乳腺癌患者血清中miRNA-195的水平較治療前降低；肝癌患者血清中增高的miRNA-500 表達水平在手術後即可恢復至正常?同時,循環miRNA 表達水平還能夠反映腫瘤患者的預後情況,在非小細胞肺癌中,低表達let-7 的患者生存時間較高表達者更短,而高表達miRNA-17a 的患者生存時間較低表達者更短?循環miRNA 表達水平還能夠幫助患者選擇較敏感的治療方法,比如激素敏感型乳腺癌患者血清中miRNA-155 表達水平顯著高於非激素敏感型患者,低表達miRNA-34?miRNA-17 和let-7a 的患者分別對5-氟尿嘧啶?多柔比星和環磷醯胺更加敏感?

血清miRNA具有樣本容易獲取?血液中可穩定存在，其在血清中的表達也早於傳統的生物標誌物，並與疾病的發生?發展密切相關的獨特優勢,是惡性腫瘤理想的診斷和腫瘤標誌物?但血清miRNA的檢測存在一下問題: ①暫無公認的miRNA定量實驗的內參?②未建立完整的血清miRNA表達譜,亦無權威資料庫對相關數據收集驗證;③血清miRNA的來源仍未完全明確,其表達水平是否受其他因素(如炎症等)影響暫無定論。

5、組織細胞腫瘤標誌物

組織細胞腫瘤標誌物(tissue and cell tumor marker)是指組織細胞發生惡性變時，細胞或組織內發生標誌性變化的蛋白質或基因，這些標誌物可反映腫瘤生物學特性，主要應用於腫瘤發病機制研究、臨床治療方案選擇和預後判斷。

組織細胞腫瘤標誌物主要涉及:①細胞分化標誌，如雌激素受體(ER)和孕激素受體（PR)等;②細胞增殖標誌，如生長因子及其受體和端粒酶( telomerase)等;③轉移潛在性標誌，如nm23基因產物、整合素（integrin)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等;④癌基因與抑制癌基因，如myc、H-ras、HER-2/neu、p53和視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)基因等。