基因治療又一次的黃金時代
來源：醉心科學公眾號
2016年美國6歲小女孩 ElizaO『Neill 開展了一項「神奇」的基因治療。她患有一種叫做沙費利波綜合征IIIA型（Sanfilippo syndrome III A）的罕見遺傳病，引發體內寡聚糖的過度累積，逐步對機體造成損傷，阻礙智力發育，通常情況下，成年前會引起死亡。
為了爭取一線生機2016年5月10日，俄亥俄州哥倫布全國兒童醫院的醫生團隊將一種稱為AAV的無害病毒注入Eliza血液中。目前為止，Eliza一直反應良好。媽媽Cara表示：「現在，她會用眼神跟我們交流，並試圖開口說話。我們在她的眼睛裡重新看到了光彩。
」基因治療真的那麼「神奇」嗎？它是如何發展的，未來又將走向何方？
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基因治療：半個世紀的浮沉
1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋的結構模型，是分子生物學劃時代意義的偉大事件，從此生命科學的研究進入到了分子水平。半個世紀以來，分子生物以空前的速度迅猛發展，極大的推動了基因工程技術和基因治療的發展。不久之後，Nirenberg和Khoran等人相繼破解了遺傳密碼，揭示了從DNA到蛋白質的閱讀方式為三個鹼基組成的三聯體對應一種氨基酸，為我們打開了解人類基因奧秘的大門。
1957年Crick提出了遺傳信息傳遞的中心法則：DNA→RNA→蛋白質。1970年巴爾的摩（Baltimore）提出了RNA病毒在宿主細胞中的複製過程是先以病毒的RNA分子為模板合成一個DNA分子，再以DNA分子為模板合成新的病毒RNA，被稱為逆轉錄，是中心法則的重要補充，為如何實現高效表達外源基因提供了理論支撐，從此基因治療逐漸步入人們的視野。
黑暗中的探索（1960s-1980s）
1963年美國分子生物學家、諾貝爾生理學或醫學獎獲得者喬舒亞·萊德伯格（Joshua Lederberg）提出了基因交換和基因優化的理念。隨著分子生物學技術的進一步發展，同源重組技術為代表的基因工程技術蓬勃發展，基因治療具備了最基本的條件。
在黑暗中摸索的人們開始了大膽的嘗試：經過多年的研究，1968年Rogers和Pfuderer第一次在煙草花葉病毒中實驗證實了病毒可以作為一種載體實現基因傳遞的作用。隨後，他們在人體上第一次開展了基因治療的嘗試，運用野生型的肖普氏乳頭狀瘤病毒過表達精氨酸酶來治療患精氨酸血症的一對姐妹。可惜的是，這次試驗失敗了，沒有檢測到精氨酸酶水平的升高，後來證實這種病毒體系無法表達精氨酸酶[1]，幸運的這次試驗沒有對患者造成傷害，但是在那個無論對疾病還是基因遞送和表達體系都不清楚的年代，這項試驗顯然是非常大膽的。
1980年前後，美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）的馬丁·克萊因（Martin Cline）在再一次對基因治療發起了挑戰，這次他們選擇的是地中海貧血症。他們利用DNA重組技術將β-球蛋白導入患者的骨髓細胞中，然後回輸到體內。本次嘗試因為效率非常低下而再次失敗了，同時本次實驗也受到了更廣泛的質疑。調查發現克萊因並沒有獲得UCLA倫理委員會的批准，而且前期的動物實驗並沒有效果就直接應用到人體中[2]。克萊因本人也因為違反美國聯邦法規而受到了嚴厲的制裁，同時被剝奪了系主任的職務。
這兩起基因治療的嘗試，讓人們意識到基因治療不僅門檻很高而且面臨著更為複雜的倫理問題，這樣沒有監管的盲目嘗試是極其危險的。不久美國NIHDNA 重組委員會組建了基因治療分委員會，經過討論人們逐漸意識到擺在面前的幾個障礙：首先是如何實現高效的DNA整合，如何準確的獲得特定的功能基因；其次如何在靶細胞中高效的傳遞目的基因。在這些困難沒有解決之前，基因治療不可能成功。這標誌著基因治療已經開始逐漸走向正軌，逐漸開始規範化和系統化。
冒進式的快速發展（1990-2003）
1984年西斯特公司的穆利斯（K.B.Mullis）開發的聚合酶鏈式反應（PCR）技術首次獲得成功，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。PCR技術的完善和基因克隆技術的逐漸成熟，使人們能夠準確的獲取目的基因。1970年巴爾的摩（Baltimore）發現的逆轉錄病毒，不僅完善了中心法則，更是為基因治療提供了高效的導入方法。此外，腺病毒、腺相關病毒（AAV）和慢病毒等病毒系統也逐漸被開發利用[3]。
至此，基因治療的主要障礙逐漸被攻克，多個研究組的體內外動物實驗也驗證了病毒介導的基因糾正和替代的可行性和有效性。人們再一次相信基因治療近在咫尺了，眾多的臨床試驗如雨後春筍般一個個開展起來。
1990年美國NIH的威廉·弗倫奇·安德森（William French Anderson）開展了世界上首例正式批准的人體臨床試驗[4]，利用逆轉錄病毒編碼腺苷酸脫氨酶（ADA）來治療重症聯合免疫缺陷病（SCID）。
首先從四歲女孩阿莎提·德席爾瓦（Ashanti DeSilva）提取白細胞，然後將編碼正確ADA基因的逆轉錄病毒插入到白細胞基因組中，然後將細胞回輸到體內。後續檢測發現，女孩體內能正確合成腺苷酸脫氨酶，但是由於白細胞存活時間短，需要經常接受類似的治療。儘管該療法是否真正意義上獲得成功還有爭議，但是該臨床試驗都是基因治療歷史上重要的里程碑。
隨著這次基因治療的成功，大量的公司和研究機構紛紛湧入基因治療領域，其中絕大部分是腫瘤的基因治療。然而就在基因治療蓬勃發展的過程中意外出現了，1999年9月13日，傑西·格爾辛格（Jesse Gelsinger）成為了第一例因基因治療死亡的病例[5]。傑西身患鳥氨酸氨甲醯基轉移酶缺陷（OTC），在由賓夕法尼亞大學的詹姆士·威爾森（James Wilson）領導的I期臨床試驗中，注射高劑量的編碼OTC基因的腺病毒後引起強烈的免疫排斥反應，導致多器官衰竭而死亡。
據FDA調查，此次惡性時間的發生與賓夕法尼亞大學的違規操作不無關係，臨床前的猴子試驗中有兩隻死亡，沒有引起實驗人員的足夠重視，也沒有及時通知FDA，更沒有告知病人及家屬此項臨床試驗的風險性。因為這次事件，基因治療進入了最黑暗的一段時間，造成了人們對基因治療的恐懼和排斥。有些科學家也對基因治療開展的過快表示擔憂，並呼籲基因治療需要「重回實驗室」。
2000年，法國內克爾醫院研究組報道了利用逆轉錄病毒感染骨髓細胞成功治癒X-連鎖重症聯合免疫缺陷症（X-SCID）[6]。但是3年後，在20個接受治療的患者中，有5位發展成白血病，其中1位死亡，後來發現誘發白血病是因為逆轉錄病毒在基因組中的隨機插入激活了癌基因的表達所致。
這兩起病人惡性事件極大的打擊了基因治療的發展，造成了基因治療最為黑暗的10年。但同時也使人們慢慢從巨大的商業利益中清醒，重回理性：更深入的了解疾病的機理，尋找更為高效的基因遞送系統，針對性的設計基因治療策略，更加重視安全性的評估。
國內相關領域開展的較晚，不過2003年中國深圳的宜家公司——賽百諾異軍突起。公司開發的抗腫瘤基因藥物（今又生）由國家食品藥品監督管理局批准生產，該注射液由通過修飾的腺病毒載體編碼p53基因（抑癌基因）組成。「今又生」的獲批批准，成為世界上第一個獲准上市的基因治療葯，但是該項目的獲批引起國內外的廣泛爭議。
回歸理性（2009-至今）
經理了黑暗的十年之後，基因治療緩慢的走出困境，以更加成熟的姿態重回大眾的視野。經歷過以前慘痛教訓之後，人們開發出更安全有效的病毒載體，比如2002年JamseWilson開發了重組AAV2/8 系統能高效靶向肝臟細胞[7]，第二代和第三代慢病毒包裝體系以及自身失活型（SIN）的慢病毒骨架進一步提高的安全性。
2003年人類基因組測序完成以來，測序技術飛速發展，不僅使我們更加深刻的理解生命，也為更合理的設計基因治療策略，更方便的進行安全性和有效性評估提供了良好的平台。基因編輯技術的發展，尤其是2013年以來CRISPR-Cas9技術的發展，為我們高效的進行基因操作提供了強大的工具。
2009年賓夕法尼亞大學在柳葉刀雜誌[8]報道通過AAV2過表達RPE65成功治療雷伯氏先天性黑蒙症（LCA）。2011年，英國倫敦大學在新英格蘭[9， 10]報道通過AAV8過表達凝血因子IX，體內凝血酶表達水平2%-11%之間，出血次數大大減少，除了谷丙轉氨酶略微升高沒有其他不良反應。
2012年第一例基因治療藥物Glybera（來自uniQure公司）在歐盟獲批上市，開始的基因治療的新時代。該產品採用AAV1過表達的方法治療脂蛋白脂肪酶缺陷（LPLD），不過該藥物售價100萬美元，四年來只用了一次。 2016年歐盟第二例批准的基因治療藥物來自製葯巨頭葛蘭素史克（GSK）的Strimvelis，用於治療重症聯合免疫缺陷病（ADA-SCID），這是基因治療走向臨床的有一個里程碑。
除此之外，自2014年以來，Spark公司的的SPK-RPE65治療雷伯氏先天性黑蒙症（LCA），與輝瑞公司合作的SPK-9001治療B型血友病； BluebirdBio公司的LentiGlobin治療地中海貧血；uniQure的AMT-060治療B型血友病以及 AVeXis公司的FDAAVXS-101等先後獲得美國FDA授予的「突破性療法」資格。「突破性療法」旨在加速開發及審查治療嚴重的或威脅生命的疾病的新葯。
同時uniQure的AMT-060治療B型血友病也獲得的歐洲藥品管理局（EMA）授予了重點藥品快速審評（PRIME）資格，PRIME（Priority Medicines）是EMA在2016年3月推出的一個快速審評項目，旨在加速醫藥短缺領域重點藥品的審評進程。入圍PRIME的實驗性藥物，將在臨床試驗及藥品開發方面獲得EMA的大力支持，以加速真正創新藥物的開發及審批，來滿足對有前景新葯的醫療需求。
21世紀以來以核酸酶為代表的基因編輯技術蓬勃發展[11]，比起傳統的同源重組技術，不僅更加高效而且操作更加靈活；跟現在常用的利用過表達基因來實現基因治療相比，利用基因編輯技術的基因治療能實現永久的治癒，但同樣也面臨更大的挑戰。而且，大範圍核酸酶，鋅指核酸酶，TALE核酸酶以及近幾年火熱的CRISPR-Cas9技術的應用，極大地拓展了基因治療的策略和手段，比如我們既可以對突變基因進行原位的修復，也可以在安全位點（例如AAVS1位點）定點整合，不僅可以實現永久的基因治療，而且更加安全有效。但是目前大多試驗停留在動物水平上，張峰的Editas公司宣稱要在2017年開展基因編輯技術進行基因治療的臨床試驗。
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基因編輯和基因治療的倫理爭端
因治療技術分為體細胞的治療和生殖細胞的治療。體細胞治療主要指利用基因工程技術在病人細胞內校正給病人的遺傳缺陷，而生殖細胞治療是指對人體的精子、卵子或者受精卵進行基因修飾從而達到治療遺傳病的目的。理論上生殖細胞治療能夠徹底根治遺傳病，但是由於目前技術不成熟，一旦技術上發生問題很難糾正，可能傳給後代從而擴散到人群中，更重要的是對生殖細胞的基因修飾有可能定點改變人的正常特性，比如可能讓人更聰明，或者體格更健壯等，有可能帶來嚴重的倫理爭端。所以為了避免未知的風險，目前絕大多數人認為基因治療主要限定在體細胞治療，不能在生殖細胞中開展。
體細胞基因治療的倫理問題
體細胞的基因治療並非沒有倫理爭端，早期的基因治療失敗的教訓很大程度上就是因為沒有處理好相關的倫理問題引起的，主要包括受試者的知情同意問題，研究者和受試者之間的利益衝突以及科學家的科研責任和社會責任等。以著名的1999年傑西。 格辛戈死亡事件為例，本次臨床試驗嚴重違背倫理審查，首先研究團隊對招募患者存在誤導和欺騙，網站沒有公布猴子試驗的免疫排斥和死亡的實驗結果，而且最後簽署的知情同意書也沒有提及。
其次，威爾森實驗室有意向NIH的重組DNA委員會隱瞞了向受試者肝內注射病毒載體這一事實。而且為保護患者利益，應避免研究人員和受試者直接接觸，特別是當時威爾森還擁有公司並對基因治療相關技術擁有專利權，更應該避免研究人員和受試者的接觸，因為受到經濟利益的影響，更容易讓研究人員出現誇大研究效果，隱瞞潛在的風險等問題。
生殖細胞基因治療的倫理問題
生殖細胞的基因治療的爭議一直以來爭議不斷，早期的研究由於技術條件比較落後，所以大部分還是堅決反對針對生殖細胞的基因治療。爭論的焦點在於當技術發展到什麼程度可以放開對生殖細胞的治療，治療應該限定什麼樣的條件。
隨著基因編輯技術的發展，特別是2013以來年CRISPR-Cas9技術的飛速發展，有些人認為現在對生殖細胞編輯的時代是否來臨？各種討論和爭議接踵而來，2015年3月《麻省理工科技評論》雜誌上發表了一篇名為「定製完美嬰兒」的文章[12]中，作者表達了對於CRISPR技術應用於人類胚胎的擔憂：一方面由於CRISPR系統存在的脫靶效應，可能會在非靶位點的位置產生切割效應；另一方面，CRISPR/Cas9並不能在胚胎中造成100%的切割，而且不同細胞產生不同的切割效應，很難保證在所有細胞中都得到相同的精確修飾。
隨後2015年4月18日，中山大學黃軍就等[13]在《蛋白質與細胞》雜誌上發表文章，利用CRISPR/Cas9技術對人類胚胎中導致β型地中海貧血症的致病基因進行了修飾，這是首次對人類自身胚胎進行的突破性基因編輯嘗試。儘管該研究所使用的是醫院人工授精過程中廢棄的不能正常發育的人類胚胎，並於實驗48小時後終止實驗，而且獲得了中山大學附屬第一醫院倫理委員會的批准並符合相關法律，但是該論文一經發表，立刻引起了生命科學界的激烈討論和國內外媒體的廣泛關注，英國生物學家愛德華·蘭菲爾在《自然》雜誌上對這一研究進行批評，認為應該暫停此類研究，並表示需要廣泛討論後才能進行下一步研究。
哈佛大學醫學院幹細胞學家喬治·戴利認為，這是國際上首次報道成功使用CRISPR/Cas9技術對人類胚胎細胞進行的基因編輯，這一研究無疑具有里程碑意義，但是絕對不要誤以為已經可以將這項技術應用於人類疾病治療。倫理學家擔心如果該技術一旦應用到生殖細胞中，是否能會造成人工設計嬰兒，從而改變人的身高、智力甚至容貌，給人們帶來未知的恐慌，加劇社會矛盾。
這一事件引起的全世界範圍的廣泛爭論，2015年5月NatureBiotechnology[14]邀請基因編輯領域的大牛Jenniferdoudna， Emmanuelle Charpentier， Feng Zhang，Qi Zhou，J Craig Venter以及社會各界人士針對CRISPR-Cas9 技術編輯人類生殖細胞的倫理問題進行的深入的討論，從科學上、社會上等各個方面發表的不同的看法。這些激烈的爭論也間接的促成了2015年12月為期三天的人類基因編輯國際峰會的召開，來自世界各地基因編輯領域的頂尖學者共同探討飛速發展的基因編輯技術的基礎研究變革、潛在應用，以及這項革命性技術帶來的科學、倫理和監管問題。
在華盛頓會議結束後發表的聲明中明確表示，因為生殖細胞的臨床應用將會作用在被編輯後代的所有細胞上， 該編輯基因會傳至其後代並成為人類基因庫中的一員。生殖細胞的基因編輯還存在各種技術層面、社會層面以及倫理道德層面的問題， 其安全性目前還無法估計， 且一旦被編輯的基因進入人類基因庫， 該影響不可逆， 不受地域限制。在目前狀況下禁止用於人類生殖的相關細胞系（包括精子、卵和早期胚胎）的基因修飾和編輯，這也是第一次在這樣的國際會議上達成的共識。但是，大會鼓勵基因編輯技術的基礎研究以及在體細胞層面上的臨床應用。
然而僅僅過去了三個月，2016年2月1日英國人類受精與胚胎管理學管理局（HFEA）宣布，弗朗西斯克里克研究所發育生物學家凱西?尼婭坎和她的團隊獲得一項「包括對人類胚胎進行基因改造」的新實驗室研究許可證。管理局允許尼婭坎對人類胚胎進行為期14天的實驗，且該實驗只能以研究為目的，研究人員不能將胚胎編輯用於臨床，也不能將編輯後的人類胚胎植入女性體內。
2016年4月22日，日本生命倫理專門調查委員會宣布，允許日本相關機構在基礎研究中「編輯」人類受精卵的基因，但出於安全和倫理方面的考慮，不允許將該技術應用到臨床和輔助生殖中。該委員會指出，涉及受精卵基因編輯的基礎研究和臨床研究的分界線，在於是否將經過基因編輯的受精卵放入子宮。此外，有關「設計」特定容貌和能力的基礎研究也不會被允許。受精卵基因編輯的基礎研究還必須公布實施情況，保持透明度。
然而時隔一年不到，2017年2月14日美國在設置了諸多前提的情況下，對基因編輯是否可以用於人類生殖細胞謹慎放開。美國國家科學院與美國國家醫學院下屬的人類基因編輯委員會發布了一份長達261頁報告[15]，表示在嚴格的監管和風險評估下，基因編輯技術可用於對人類卵子、精子或胚胎的編輯，但僅限於父母雙方均患有嚴重遺傳疾病、想要健康的孩子卻別無選擇時。報告還提出了必須滿足一下10條規範標準，生殖細胞的基因編輯才被允許：
（1）僅當不存在其他的「合理的替代選擇」時，才使用基因組編輯；
（2）它僅用於阻止一種「嚴重的疾病或癥狀」；
（3）這種使用僅限於修飾「有力地證實導致或者非常傾向於患上這種疾病或癥狀」的基因；
（4）這種使用僅限於將基因轉化為「在人群中普遍存在的、已知與正常的健康相關聯的版本，而且沒有或者很少有證據證實副作用的存在」；
（5）針對使用這些技術的潛在風險和潛在健康益處，存在可靠的臨床前和/或臨床數據；
（6）在臨床試驗期間，針對這些技術對研究參與者的健康和安全性的影響，進行持續的和嚴肅的監管；
（7）存在一種尊重個人自主性的「長期多代隨訪（long-term， multigenerational follow-up）」全面計劃；
（8）在確保最大透明度和尊重病人隱私之間保持平衡；
（9）持續地重新評估健康益處和風險，以及社會益處和風險，包括利用公眾提供的輸入信息；
（10）建立可靠的監管以便防止出於阻止一種「嚴重疾病或癥狀」之外的原因使用這些技術。
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未來如何發展？
當科學與倫理相遇時，我們就不能拋開科學談倫理，更不能拋開倫理講科學，我們時時刻刻都在享受的科學的飛速發展所帶來的便利，但是當科學的發展超過的我們現有的倫理範疇，我們應該有必要減慢一下發展的速度，至少暫緩在實際中的應用。1975年阿西洛瑪會議給我們做了一個很好的榜樣，發現DNA重組技術可能存在潛在的生物危害，以伯格和羅伯特·波洛克為首的科學家呼籲自願「暫停」重組DNA技術的相關研究，並號召全世界科學家和公眾廣泛參與科學政策的討論。
我們現在又步入了一個新的十字路口，隨著基因編輯技術的日漸成熟，基因治療又重新進入了一個黃金時期，走在時代前沿的科學家們更應該保持清醒的頭腦，站在人類社會發展的角度上，承擔更多的社會責任，來應對新技術可能引起的倫理問題以及如何在科研群體中建立良性的自我約束和監督機制。只有這樣才能再次避免基因治療早期所遇到的慘痛教訓，也只有這樣基因治療才能健康的發展。
參考文獻
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