【每周一課】NO.86 鄔玲仟教授：產前遺傳病檢測方法

鄔玲仟，醫學遺傳學博士，教授，婦產科一級主任醫師，博士生導師。現任中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室副主任、湘雅醫院產前診斷中心主任、湘雅醫院生殖醫學中心副主任、湖南家輝遺傳專科醫院首席醫學遺傳醫師。兼任中國醫師協會醫學遺傳醫師分會會長、中華醫學會醫學遺傳學分會副主任委員、國家衛計委產前診斷專家組專家、產前診斷培訓基地負責人。長期致力於遺傳病發病機制、診斷與產前診斷技術研究、教學和臨床服務，率先在國內建立了以微晶元和高通量測序技術為核心的遺傳病診斷和產前診斷高技術平台及其技術標準和規範、研發「染色體非整倍體無創產前篩查技術」在國際上首家獲得臨床許可並在全國推廣應用，創建「循環單分子擴增重測序技術（cSMART）」率先突破單基因病無創產前診斷，被美國臨床化學學會（AACC）譽為「分子診斷的革命性突破」。

【本期課程摘要】

一、產前診斷

1. 產前診斷（prenatal diagnosis）的定義：是指對胎兒進行先天性缺陷和遺傳性疾病的診斷，檢測手段包括：影像學、生物化學、細胞和分子遺產學，以及分子生物學等。

2. 產前診斷的好處：（1）陰性結果使孕婦安心；（2）明確診斷疾病，部分疾病可提供產前治療；（3）選擇合適的生育場所儘可能保證安全分娩；（4）選擇合適醫院對患病胎兒提供出生時治療；（5）提供終止妊娠的機會；以利於提高人口素質，降低出生缺陷。

二、遺傳病與遺傳學檢測方法

1. 遺傳病包括：染色體病（包括染色體數目異常、片段缺失與重複、微缺失與微重複）、基因組病、單基因病（單基因病、多基因病、線粒體病），多基因病，體細胞突變遺傳病等。

2. 產前診斷的對象是嚴重遺傳性疾病，是指由於遺傳因素先天形成，患者全部或者部分喪失自主生活能力，後代再現風險高，醫學上認為不宜生育的遺傳性疾病，包括染色體病、基因組病以及一部分嚴重的致愚、致殘、致死性的單基因病。

3. 遺傳學檢測方法

染色體病和基因組病目前已經有很好的檢測平台，染色體疾病診斷顯帶技術平台可以一次性看到46條染色體數目或結構異常；基因組病染色體微缺失微重複診斷技術平台通過晶元或高通量測序，也可以一次性看到整個細胞基因組的異常；但是，單基因疾病共有7000多個，目前能夠檢測的有3000多個，不同的疾病有不同的遺傳病理特點，選擇的檢測方法也不一樣，因此，臨床醫生需要對這部分疾病有深刻的認識，選擇恰當的檢測技術，才能更好地實現產前診斷和諮詢。

遺傳學檢測方法包括以下幾種：

1)染色體核型分析：通過顯帶技術（如G顯帶）來檢測染色體數目或結構是否存在異常；其解析度有限，多大於5MB（整個基因組是2.8GB，大部分實驗室是做320-400條帶，這種情況就要大於10MB），因此無法分辨小的染色體缺失或重複。

2)基因組拷貝數變異檢測：通過染色體微陣列晶元（如SNP-array）等方法檢測染色體微小片段的缺失或重複；解析度＞100KB，也有局限性，無法分辨幾個KB片段的缺失或插入。

下圖所示為一例染色體插入突變病例，患者表現為智障，小頭畸形，生活可以自理，當地查染色體核型為正常，晶元結果顯示9號染色體長臂有16MB的重複。

3)Sanger測序和MLPA技術：對於單個鹼基水平，可利用sanger測序，即一代測序，解析度從1bp到數百bp，可用於檢測單個基因；MLPA（多重連接探針擴增技術）若是針對一個基因的一到兩個外顯子的缺失或重複，或是針對靶序列的點突變、缺失或重複的檢測。

4)二代測序（NGS）：可以一次檢測單個基因（single gene）、一組基因（gene panel）、在線人類孟德爾遺傳 (Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)基因外顯子、外顯子組（exome），及全基因組（whole genome）；解析度達到1bp。現在隨著這項技術的價錢逐漸降低，應用得到推廣，但後兩種檢測由於其價格相對較高，解析度高，會發現大量無法與表型關聯的變異，一般用於用於新生兒先證者的檢測。

下表展示了各種遺傳學檢測方法的優缺點：

三、遺傳學檢測方法在產前診斷中的應用

1.評估

1)評估胎兒患遺傳病的風險：

a)胎兒狀態：有無畸形、生長發育遲緩等；

b)孕婦孕期有無特殊：孕婦年齡，是否接觸有害物質，產前篩查有無異常等；

c)其他：羊水量，胎盤狀況，是否為試管嬰兒等；

d)家族史：非常重要，夫婦是否為染色體異常攜帶者，是否生育過嚴重缺陷新生兒，家族中是否有遺傳病患者等。

2) 評估胎兒患遺傳病的種類：

a)染色體病：①羊水過多或者過少；②胎兒發育異常或者有可疑畸形；③孕早期接觸過可能導致胎兒先天缺陷的物質；④曾經分娩過先天性嚴重缺陷嬰兒或者生育過染色體異常患兒；⑤夫婦雙方之一為染色體平衡易位、倒位或插入攜帶者；⑥孕婦年齡超過35周歲；⑦產前篩查提示胎兒染色體疾病高風險。

b)基因組異常病： ①胎兒發育異常或者有可疑畸形；②孕早期接觸過可能導致胎兒先天缺陷的物質；③夫婦曾生育過智力低下、發育遲緩或器官畸形的患兒，且經過遺傳學檢測診斷為基因組病；④夫婦雙方之一為基因組病攜帶者；⑤產前篩查提示胎兒基因組疾病高風險。

基因組病異常的評估標準大體與染色體病相似，但其獨有的一大特點是與母親年齡無關，只與基因組自身結構有關，每個個體基因組都含有低拷貝重複序列、串聯重複序列等，這些重複序列發生非等位同源重組，導致染色體的缺失或重複，通常為小片段缺失或重複，可以導致智力障礙，生長發育遲緩，及多發畸形等。

c)單基因病：①夫婦為隱性致病基因攜帶者或夫婦一方是顯性遺傳病患者；②曾生育過單基因病患兒；③胎兒發現明顯畸形，高度懷疑為某一遺傳病（此種產前診斷較為困難）。

d)線粒體疾病、多基因遺傳病、體細胞突變遺傳病：與單基因病類似，但其產鉗診斷膠南進行，且由於很難以評估胎兒將來表型。一般不做產前診斷。

3)評估孕婦能否進行有創產前診斷：

a)有創產前診斷的禁忌症：①完全性前置胎盤；②先兆流產未穩定；③孕婦體溫超過37.2℃。

b)有創產鉗診斷慎用：①邊緣性或部分性前置胎盤；②孕婦為病毒攜帶者，如HBV，HIV；③孕婦血性為RH陰性。

2.檢測

1)選擇合適的取材方法和時間:

下表為不同取材方式的手術時間，胎兒丟失率及併發症風險：

2)選擇恰當的遺傳學方法進行檢測：

研究顯示，如胎兒B超有異常，基因晶元檢測，遺傳疾病檢出異常檢出率為6%，如B超無異常，只是篩查高風險，基因晶元遺傳異常的檢出率1. 7%，有顯著性差異。指南規定建議，如B超有異常，首先做晶元或高通量測序，而不是染色體核型檢測；如B超無異常，只是篩查高風險，可以選擇染色體核型或晶元檢測。單基因疾病是根據特定疾病來選擇相應的檢測方式。

下面以假肥大性肌營養不良（DMD）來說明單基因病如何選擇恰當的遺傳學方法進行檢測。

首先，對710例DMD樣本基因檢測結果進行分析，發現陽性結果佔94.5%，其中大片段缺失或重複變異佔72.7%，單個或小片段核苷酸變異佔21.8%，陰性結果佔5.5%。因此，DMD先證者診斷首選MLPA，先找大片段的缺失或重複，若MLPA陰性，再做一代或二代測序，尋找點突變，若結果為陰性，原因可能為診斷錯誤或突變不在檢測的目標區域內。DMD檢測流程見下圖。

由此可見，先證者的診斷了解單基因病的突變類型非常重要，有助於選擇恰當的檢測方法，並幫助確認臨床診斷的正確性。

3.結果：

1)分析檢測結果：

a)陽性結果：確定胎兒患遺傳病；

b)陰性結果：排除胎兒患某種或某類遺傳病風險；

c)臨床意義不明的結果：發現有變異，但不能確定該變異是否會導致胎兒患病。原因是染色體異常大部分是新發的，拷貝數變異（CNV）更是90%以上是新發的，即父母染色體正常，但在受精卵形成的過程中產生異常。這一類結果尤其要做好遺產諮詢，並且要做好新生兒隨訪，形成資料庫，以指導以後相同結果的諮詢。

下圖為臨床意義不明的結果的一個案例：

d)意外發現：發現與檢測目的無關的信息。

2)遺傳諮詢：

a)遺傳諮詢（Genetic Counseling）定義：是由臨床醫生和遺傳學工作者，解答遺傳病患者及家屬剔除提出的有關遺傳性疾病的病因、遺傳方式、診斷、治療及預防等問題，估計後代再患某病的概率，並提出建議及指導，一共以供患者及其親屬參考。

b)產前診斷中遺傳諮詢的特殊性：

i.胎兒不一定在孕期表現出相應的表型；

ii.是否建議孕婦終止妊娠（倫理、種族、宗教等）；

iii.檢測材料的特殊性；

iv.懷孕時間與檢測時間的矛盾性。

c)幾種特殊情況：

i.嵌合體：很難評估表型，可以在諮詢中告知最嚴重和最輕的情況；

ii.外顯不全：在一個家系裡，有的癥狀嚴重，有的癥狀很輕，要將這種情況告知病人；

iii.延遲顯性：根據患者的要求，若有治療的方法要告知患者以利於及早治療。

下圖顯示的是8號染色體三體嵌合體的一個案例。該案例中患者沒有智力障礙和嚴重畸形，生活可以自理，就診原因是妻子反覆流產兩次。行143個核型分析，其中138個8號染色體三體，僅有5個核型正常。

鄔教授分享的最後一個案例是脆性X綜合征（fragile X syndrome），典型的臨床表現為臉長，耳朵大，巨睾丸，智力障礙等。下圖及表展示了其遺傳病理學。

如上表所示，CGG重複數在正常人為5-44次；當重複達到55-200次，其轉錄增加，翻譯減少，女性表現為卵巢早衰， 男性50歲左右會共濟失調和震顫；當重複達到200以上，基因上游CpG島會甲基化，導致基因沉默，男性導致智力障礙，女性根據X染色體失活比例不同，有些成為攜帶者而表型正常，有些表型為脆性X綜合征。

脆性X綜合征中，超過95%是由於CGG重複擴展的動態突變和異常甲基化而導致的FMRP蛋白合成減少或缺失所致；不到5%是由於FMR1基因的缺失突變或點突變而導致FMRP蛋白功能異常而致病；還有12-41%的患者存在嵌合。

綜合以上情況，下表展示了脆性X綜合征的檢測策略。可以看出，在檢測策略中，用熒光PCR作為篩查手段，產前診斷用Southern基因組印記，原因是CG之間有三個氫鍵，導致其連接緊密，因此CG含量高PCR擴增難，而脆性X綜合征的診斷需要把大片段的CGG重複擴增出來，PCR檢測常只有存在短片段擴增的優勢擴增，長的擴增不出來，於是會漏掉嵌合狀況。

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