DNA甲基化檢測隨心選

DNA甲基化，通常是指CpG島上第5位胞嘧啶鹼基上的甲基化標記（5-mC）。這被人們稱為「第五種鹼基」。它是一種重要的表觀遺傳學標記，可能明顯改變基因的時空表達和染色質重塑。

最近的一篇綜述顯示，5-mC參與了基因組印記、X染色體失活、轉座子抑制、基因調控和表觀遺傳記憶的維持。最近的研究還表明，公認的原核生物甲基化標記N6-甲基腺苷也存在於真核生物DNA中。

既然研究人員這麼熱衷於檢測5-mC及其衍生物，生命科學領域的廠商就開發出許多種試劑和試劑盒，以協助他們開展研究。

檢測隨心選

據Lalancette介紹，密歇根大學的表觀遺傳學核心實驗室提供幾種服務。客戶最常訂購的是ERRBS（增強精簡表示亞硫酸氫鹽測序），這種方法可以單核苷酸的解析度檢測5-mC。基因組DNA被限制性內切酶片段化，然後跑膠。通過選擇150-400 bp範圍內的片段，用戶可獲取基因組內大多數富含CpG的區域，從而最大程度提高下游測序的效率。

這種方法離不開亞硫酸氫鹽轉化，這個過程將未甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。通過比較處理和未處理的測序片段，研究人員可以確定哪些鹼基被甲基化。亞硫酸氫鹽轉化試劑盒可從多個廠家購買，包括Active Motif、默克密理博和Zymo等。

對於那些需要了解局部甲基化狀態的研究人員，Lalancette的實驗室提供定向MassARRAY測序。它通過亞硫酸氫鹽轉化、PCR擴增和體外轉錄，然後對尿嘧啶殘基進行特異切割，從而檢測甲基化的鹼基。這個結果可在專門的飛行質譜儀上讀取，如Agena Biosciences的平台。「MassARRAY被認為是甲基化定量的金標準，」Lalancette談道。

另外一個受歡迎的檢測產品是確定5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的位置。5-hmC是5-mC的一個變種，似乎有著不同的表觀遺傳學功能。然而，亞硫酸氫鹽轉化不能區分這兩種標記，因此研究人員開發出新的方法。Lalancette的實驗室利用抗體來富集含有5-hmC的DNA，之後進行DNA測序。這種策略帶來了區域性的解析度，而非核苷酸水平。

解析度更高

檢測5-hmC當然還有其他方法，如TAB-seq和OxBS-seq，這兩種方法在亞硫酸氫鹽轉化之前處理DNA，以改變甲基化和羥甲基化鹼基的反應。在TAB-seq中，5-hmC經過β-葡糖基轉移酶的處理被保護，而5-mC則被Tet酶轉化成5-羧基半胱氨酸。隨後的亞硫酸氫鹽轉化將5-caC讀取為T，將5-hmC讀取為C。OxBS-seq利用化學氧化將5-hmC轉化為5-甲醯胞嘧啶，它在亞硫酸氫鹽轉化後讀取為T，而5-mC讀取為C。在這兩種情況下，比較測序產生的序列可發現修飾的鹼基。

另一個區分這兩種修飾的方法是利用Pacific Biosciences的SMRT測序。SMRT測序根據核苷酸摻入的動力學來自動區分5-mC和5-hmC上的胞嘧啶。據這家公司的首席科學官Jonas Korlach介紹，這個參數被稱為脈衝持續時間。不過通過糖基化修飾5-hmC之後，這個信號更容易分辨。

ELISA方案

對於那些不需要核苷酸水平解析度的研究人員而言，Active Motif、默克密理博和Zymo提供了ELISA檢測，可探索整體的甲基化改變。Active Motif利用生物素化的寡核苷酸來捕獲細胞中相對一部分的甲基化區域，這些寡核苷酸與CpG島中的LINE重複序列互補。隨後捕獲的DNA被固定在微量滴定板上，與5-mC抗體孵育，並利用顯色試劑檢測。據介紹，它可以檢測到樣品之間0.5%-1%的差異。

研究甲基化DNA的其他試劑包括專門的甲基化DNA標準品、酶、抗體及其他。如果你希望從基因組DNA樣品中富集甲基化或羥甲基化的DNA，你可以選擇MeDIP/hMeDIP （甲基化DNA免疫沉澱）和MIRA（甲基化CpG島回收分析）產品。對於前者，甲基化DNA是利用5-mC或5-hmC抗體沉澱的，這需要單鏈DNA；而MIRA使用甲基DNA結合蛋白，它識別雙鏈DNA。

舉個例子，Active Motif的MethylCollector? Ultra kit是基於MIRA，Hydroxymethyl Collector? kit則通過糖基化和生物素化來修飾5-hmC，以實現純化。Zymo的Quest 5-hmC? DNA Enrichment Kit利用J鹼基結合蛋白（JBP）直接純化糖基化的5-hmC殘基。

當然，更多的工具正在湧現。至少有三個研究小組獨立報告了將只具有催化功能的Cas9酶與DNA甲基轉移酶或DNA去甲基化酶相融合，可控制特定位點的甲基化狀態和基因表達水平；其中一些試劑可從Addgene上獲取。考慮到DNA甲基化領域的熱度不減，未來肯定有更新的產品。大家需要多關注產品目錄或生物通。

推薦閱讀：