[轉載]枯草芽孢桿菌發酵探討

[轉載]枯草芽孢桿菌發酵探討 2014-04-23 16:36閱讀： 原文地址：枯草芽孢桿菌發酵探討 原文作者：思倍特生物 枯草芽孢桿菌是我國農業部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來越多地研製成飼用微生態製劑。因其製劑是無毒、無殘留、無污染的「綠色」添加劑，故具有廣闊的發展前景，並已在畜牧業、飼料業廣泛應用，顯示巨大的社會效益和生態效益。枯草芽孢桿菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶等活性，能產生抗菌素，在動物腸道內具有較強生物奪氧能力。這些特性對促進動物營養的消化吸收、提高動物的飼料轉化率、防病和促進生長起到重要作用。鑒於此，國內外專家學者對研究開發枯草芽孢桿菌製劑用於畜禽養殖日趨關注，從而也促進了這一產業的迅猛發展，但在現階段的工業化生產中，存在著制約枯草芽孢桿菌發酵的諸多因素。1、枯草芽孢桿菌的生物學特點桿菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，電子顯微鏡測量為（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革蘭氏陽性，運動，有長而又豐富的周生鞭毛。芽孢：橢圓形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不顯著。生長溫度：最高溫度45～55℃；最低溫度5～20℃。陽性反應：接觸酶；V-P反應；在7％的氯化鈉中生長；pH5.7生長；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產酸；水解澱粉；利用檸檬酸作為碳源；還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；分解酪素；石蕊牛奶產鹼腖化。陰性反應：厭氧生長；卵黃反應：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解馬尿酸鹽；利用丙酸鹽並分解酪氨酸。在55℃生長的菌株被0.02％的疊氮化合物抑制。變化的性質：在V-P液中產酸(pH5.0～8.0)；對溶菌酶的抗性；在10％的氯化鈉中生長。2、芽孢桿菌製劑的作用機理2.1可產生酶類和營養物質研究表明芽孢桿菌能夠分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、澱粉酶等，有助動物對飼料的降解、消化，提高飼料利用率。飼料中未被消化的蛋白質和一些含氮物質在腸道中被大腸桿菌和其他細菌脫梭生成具有潛在的毒性的腐胺、吲哚、酚類等物質。一些芽孢桿菌可產生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氫的酶以及其他抗菌物質如過氧化氫，起到殺菌作用，從而減少動物體內有害物質的產生。研究表明一些芽孢桿菌產生SOD酶，SOD可以清除生物體內活性氧自由基，減少其對細胞的毒害作用，使生物

體免受傷害。芽孢桿菌在生長繁殖過程中可以產生揮發性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低動物腸道的pH，從而為乳酸菌的生長創造條件，並且抑制病菌的生長。其中丙酸還可以參與三梭酸循環，為動物的新陳代謝提供能量。同時，能夠產生很高的維生素B和維生素C，為動物提供維生素營養。1996年Ozols對106株腸道菌進行研究發現芽孢桿菌是維生素Bl和維生素B6的主要生產者；1998年倪學勤等研究表明芽孢桿菌產生有機酸為機體提供能量營養的同時，還促進動物對鈣、磷、鐵的吸收利用。2.2生物奪氧與生物拮抗作用腸道原籍菌群是腸道的優勢菌，大多厭氧，而致病菌多為需氧菌。人為引入的益生芽孢桿菌在腸道定植後，消耗大量的遊離氧，造成厭氧環境，可減少需氧菌對腸道的定植，並有利於乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態系統平衡。芽孢桿菌與有害菌競爭基本營養物質和腸道等黏膜結合位點，抑制有害菌從而減少腸道疾病，提高機體抗病能力。2.3提高機體的免疫能力近年來研究表明，芽孢桿菌能分泌活性抗菌物質，使腸道相關淋巴組織處於高度反應狀態。同時T、B淋巴細胞的數量增多，動物體液和細胞免疫水平提高。1992年Jonsson等報道，芽孢桿菌分泌胞外酶系的同時還產生抗生素。3芽孢桿菌飼料添加劑的應用優勢乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌作為益生菌的3種主要菌種來源，各自具有不同的生物學特性，在生產上也是各有不同。相對於另外兩種微生物，尤其是應用最為廣泛的乳酸桿菌，芽孢桿菌具有獨特的優勢，主要體現在以下三個方面。3.1安全性很多種類芽孢桿菌及其代謝產物已廣泛應用於食品、飼料中，目前尚未發現毒副作用，是一種安全的菌種。許多芽孢桿菌及其代謝物很早就被人們有意無意地在食品、醫藥和飼料中使用，一些芽孢桿菌屬於「公認安全(GRAs)」的菌種，芽孢桿菌代謝產生的多種酶，如纖維素酶、澱粉酶、蛋白酶已在食品與飼料中廣泛應用。芽孢桿菌作為益生菌對動物無毒害，生產出的肉蛋類食品也是安全的。3.2代謝速度快芽孢桿菌易於分離、培養與保存，一般對營養要求比較簡單，代謝速度比較快，對於工業生產的要求不高。另外芽孢對熱、紫外線、電離輻射和某些化學藥品有很強的抗性，可忍受不良環境，比如可以在pH酸性環境生存，也可以在溫度高達80℃甚至更高的環境中生長。3.3分子加工操作簡便目前芽孢桿菌的分子生物學研究已比較深入，可以利用分子生物學工具和知識研發高產性能的菌種，提高微生態製劑的飼餵效果，比如可以把蛋白酶、木聚糖酶的基因轉移到芽孢桿菌中進行表達等，更大程度地發揮芽孢桿菌的益生作用。4枯草芽孢桿菌發酵研究所謂發酵，是藉助微生物大量生成積累特定的代謝產物的現象。發酵工程是指採用現代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產有用的產品，或直接把微生物應用於工業生產過程的一種新技術。發酵工程的內容包括菌種的選育、培養基的配製。滅菌、擴大培養和接種、發酵過程和產品的分離提純等方面。早在1975年，美國用蘇雲金桿菌(Bacillus thuringiensisBerliner)發酵制各種殺蟲劑，以後各種芽孢桿菌被應用進行發酵生產各種產物。如應用地衣芽孢桿菌產β-甘露聚糖酶；利用耐鹼性芽孢桿菌製備鹼性澱粉酶；以枯草芽孢桿菌為出發菌株發酵生產中性蛋白酶、木聚糖酶、D-核糖、A-乙醯乳酸脫羧酶、B2甘露聚糖酶、肌苷、鹼性果膠裂解酶。枯草芽孢桿菌可以以內生芽孢的形式發揮其功能。當前，研究人員已經開始對以芽孢作為發酵產物的發酵體系進行摸索和優化。張根偉等對發酵培養基的組分和其他發酵條件進行研究構建了枯草芽孢桿菌BS-6的液體發酵體系，使該菌的最後發酵水平為1.66×109CFU/mL。考慮到發酵培養基原料成本及獲得途徑便利等因素，麩皮、玉米粉、豆米粉等材料已經用於該類細菌的發酵生產，並獲得較高的芽孢產量。4.1影響芽孢桿菌發酵的因素芽孢桿菌產生的對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品有強抗性的芽孢，可忍受各種不良環境，能防治多種植物病害，易定殖在植物表面。其芽孢可以製成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型的生防製劑而應用於農業生產，此製劑具有與化學農藥混用而不失活的特性。因此，有必要對芽孢桿菌的產孢特性進行研究，以期獲得最佳產孢條件，最終獲得商品化芽孢製劑。微生物發酵的生產水平不僅取決於生產菌種本身的性能，而且要提供合適的發酵條件，才能使它的生產能力充分發揮出來。優化發酵工藝可以充分發揮菌種的潛在能力，提高發酵過程的生產效率，降低生產成本。因此，工藝優化的研究尤其重要。發酵工藝的研究可從以下兩方面入手：(1)培養基組分的影響：包括碳源、氮源、維生素和輔酶、無機鹽及微量元素等。(2)發酵條件的影響：包括溫度、初始pH、初始接種量、裝液量、轉速等。4.1.1 培養基對發酵的影響培養基是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的按一定比例配製的多種營養物質的混合物。培養基的組成對菌體生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離精製乃至產品的質量和產量都有重要影響。發酵工藝可分為斜面種子培養、種子擴大培養、發酵罐內菌體培養、和產物合成等幾個培養過程。種子培養基是供菌體生長繁殖用的，營養成分應是易被菌體吸收利用，比較豐富和完整，其中氮源和維生素的含量應略高些，但總濃度略低為宜，以便菌體的生長繁殖。發酵培養基是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產物用的。發酵培養基的組成要考慮菌體在發酵過程中的各種生化代謝的協調，在產物合成期，使發酵液的pH不出現大的波動。採用的原材料質量相對穩定，同時不影響產品的分離精製，不影響產品的質量。每個過程都有其培養基組成和製備工藝條件的要求。因此必須按照不同培養階段的微生物生理學特性提供適宜的培養基配方。4.1.1.1 碳源對發酵的影響碳源是組成培養基的主要成分之一，其主要作用是供給菌種生命活動所需要的能量和構成菌體細胞成分和代謝產物中的碳素來源。一般的微生物可以在含各種碳水化合物的培養基上良好生長，但它們產物的生產能力和碳源的種類有很大關係。碳源的種類及濃度，主要是由菌種耐滲透壓高低和調節細胞膜滲透性的方法來決定，所以枯草芽孢桿菌發酵採用的碳源主要有葡萄糖、糖蜜、澱粉、玉米粉等。目前，國內外主要選用玉米粉。4.1.1.2 氮源對發酵的影晌氮源的主要作用是微生物細胞物質和含氮代謝物的氮素來源的營養物質。氮源作為枯草芽孢桿菌發酵培養基的另一個主要因素，在芽孢的形成上也發揮著重要作用。枯草芽孢桿菌在生產中常用豆餅粉、魚粉以及(NH4)2S04等一些試劑作氮源。C/N直接影響菌體的生長和代謝，碳源轉化為微生物自身的細胞物質和代謝產物，並且是能源物質。氮源是構成微生物細胞蛋白質和核酸的主要元素，而蛋白質和核酸是微生物原生質的主要組成部分。如果C/N偏小，會導致菌體生長過剩，易造成菌體提前衰老自溶；C/N過大，菌體繁殖數量少，發酵密度低，細菌代謝不平衡，不利於產物的積累；C/N合適，但C、N源濃度過低，則會影響菌體的繁殖，C、N濃度過高，則發酵起始導致菌體大量繁殖，代謝廢物過多而增加發酵液的黏度，使溶解氧降低，引起菌體代謝異常，最終也影響產物的合成。4.1.1.3 無機鹽對發酵的影響工業發酵中應用微生物的生長繁殖和產物合成中都需要無機鹽和微量元素，如磷、硫、鐵、錳、鈣、鎂等。許多金屬離子對微生物生理活性的作用與其濃度相關，低濃度往往呈現刺激作用，高濃度卻表現出抑制作用。錳是枯草芽孢桿菌生長的必需元素，當培養基中缺少Mn2+時，不適合枯草芽孢桿菌的生長，促進芽孢的生成。提高Mn2+濃度將會導致培養基成分比例失調，滲透壓升高等一系列變化，從而誘導芽孢生成。磷在菌體生長、繁殖和代謝活動中起著極其重要的作用。一方面，磷是構成核酸、磷脂、許多輔酶或輔基(輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料，另一方面，磷在代謝調節方面也起著重要的作用，磷能促進糖代謝的進行，促進微生物的生長。因此，磷源是枯草芽孢桿菌發酵培養基中另一個重要的組成成分，它的濃度直接影響著枯草芽孢桿菌菌體的生長和芽孢的形成。鉀雖不參與細胞結構成分，但它是許多酶作用的激活劑，鉀還對細胞原生質的膠體狀態和細胞膜的透性起調控作用。鈣主要參與調節細胞的生理狀態，如：維持細胞的膠體狀態，降低細胞膜的通透性，調節pH等。4.1.2 其他發酵參數對發酵的影響4.1.2.1初始pH對發酵的影響pH是微生物生長和產物合成的非常重要的狀態參數，是代謝活動的綜合指標。為了達到微生物的充分繁殖，培養基必須保持適當的pH。初始pH的變化對於枯草芽孢桿菌的生產發酵過程影響是非常顯著的。因此，決定最佳初始pH對於細菌發酵液含菌量就顯得尤為重要。pH影響菌量的原因：1）pH會影響微生物的細胞原生質膜的電荷，使細胞原生質膜發生變化，引起原生質膜對個別離子滲透性的改變，從而影響到微生物對培養基中的一些營養物質的吸收利用以及代謝物的滲漏，進而影響微生物的生長和新陳代謝的正常進行。2）pH會直接影響到微生物細胞內的酶活性，在合適的pH下，微生物細胞內的酶才能發揮最大的活性；在不合適的pH下，微生物細胞內的某些酶的活性受到抑制，從而影響微生物的生長繁殖和新陳代謝。3）pH會影響到培養基中某些重要的營養物質和中間代謝產物的離解，從而影響微生物對這些物質的吸收和利用。4.1.2.2溫度對發酵的影響在發酵過程中需要維持生產菌的生長和生產的適當發酵條件，其中之一就是溫度。溫度對微生物生長的影響，是綜合影響各種代謝反應的結果。溫度通過影響微生物膜的液晶結構、酶和蛋白質的合成與活性，以及RNA的結構和轉錄，從而進一步的影響微生物的生理活動。高溫會使微生物細胞內的蛋白質發生變性或凝固，同時還破壞了微生物細胞內的酶活性，從而殺死微生物；而低溫又能抑制微生物的生長。任何微生物的生長都有一個最適生長溫度範圍，在此溫度範圍內，微生物生長繁殖最快。溫度過高過低，芽孢桿菌生長代謝緩慢，營養體都難以形成，芽孢則更難以在營養體內產生。4.1.2.3溶氧對發酵的影響溶氧(Dissolve Oxygen，DO)是需氧微生物生長所必需的。枯草芽孢桿菌是好氧細菌，它產孢需要有氧氣的存在。MohamedIsmail等研究過的球形芽孢桿菌(Bacillusphaerlcus)芽孢形成與溶解氧的關係一樣，發現隨著溶解氧的濃度升高，芽孢形成量越高。但溶解氧濃度過高，反而使產孢量下降，這是因為對於好氧枯草芽孢桿菌來說，在其他發酵條件一定的情況下，特別是在對數生長期和芽孢形成期，保證足夠的通氣量有利於芽孢的產生，培養基中的溶解氧水平越高越有利於芽孢的產生。但通氣量過大，溶解氧過量時，由於菌體自溶反而使芽孢數下降。這與Youset的觀點相同。研究發現，芽孢大量出現的時間均在枯草芽孢桿菌的對數生長末期和衰亡期以後的一段時間，但時間過長，芽孢數便會穩定在一個水平之上，符合芽孢形成規律。4.1.2.4初始接種量對發酵的影響接種量是指待接種的液體培養基與接入的培養液的體積百分比。由於各級種子培養時間較短，因此採用大接種量有利於菌體形成群體優勢而縮短延遲期。接種量過小則可能使延遲期延長，不利於縮短髮酵周期，但接種量過大也沒有必要，因為過大的接種量不但不能縮短延遲期，反而會帶進較多的代謝廢物而不利於培養物的生長。不同的微生物由於其生理特性的不同，要求的最適接種量大小也不同。就某種特定的微生物而言，接種量的大小既取決於其自身生理特性，同時也與培養物中微生物所處的生長時期相關。4.1.2.5裝液量對發酵的影響裝液量的多少直接影響到菌體在生長過程中對氧的獲得能力；同樣搖床轉速下，裝液量少，菌體獲得氧的含量高；裝液量多，則菌體獲得氧的含量低。氧是好氧性微生物不可缺少的營養物質之一，它參與某些物質代謝中的加氧反應。另外，氧是物質有氧降解最終的電子受體，在這個過程中，產生出微生物進行生命活動所需要的能量。對好氧性微生物來說，必須生長在有氧的環境中，供氧量的多少會直接影響到其生長或代謝作用。總之，枯草芽孢桿菌的發酵過程中，上述的每一個因素都至關重要。其中，培養基除具備微生物必要的營養要素外，還應具有合適的比例，所以應對發酵培養基進行優化。培養基優化方法多是在單因素水平試驗的基礎上進行正交實驗設計或是在正交試驗基礎上應用均勻設計理論，或者採用通用旋轉組合設計，均能對培養基優化取得較好的效果。在工業化生產中，還需要對接種量、pH、溫度、轉速、通風比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因素進行嚴格控制，才能保證枯草芽孢桿菌發酵活菌數達到最高、發酵效果最好、在動物飼料里的添加效果最理想。

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