探索你的大腦:繪製大腦聯接組

已有 196 次閱讀 2013-6-27 23:25 |系統分類:博客新聞

Jeffrey M.Perkel/文 姜天海/譯

還記得二十年前，Francis Crick和Edward Jones曾在所謂的「腦的十年（Decade of the Brain）」中哀嘆，科學界連對人類神經解剖學最基本的認識都沒有。

「很明顯，現代人類大腦解剖學所需要的是引入一些徹底革新的技術。」兩人在1993年寫道。顯然，研究者聽取了這一建議。今天，他們正在使用新技術和自動化操作，並以前所未有的解析度和完整度來繪製神經迴路。美國國立衛生研究院（National Institutes of Health）投入了近4000萬美元來繪製人類大腦線路圖，艾倫腦科學研究所（Allen Brain Institute）又追加數百萬美元的資金，用來繪製老鼠大腦的圖譜。這些數據要花上很多年去彙集，甚至要花更長的時間去解析。但結果可能會揭示人類個性的本質等重大發現。正如MIT的神經科學家Sebastian Seung所寫的：「你的個性遠不僅是你的基因決定的，而是你的聯接組。」

當Seung在《大腦聯接組：大腦聯接如何造就人類（Connectome: How the Brain』s Wiring Makes Us Who We Are）》一書中寫道「你來自於你的大腦聯接組」，他的意思是神經聯接如同指紋一樣，每個人都把他們獨特的遺傳因素、環境因素和生活經歷參雜在一起。這些因素影響了具體的大腦迴路，就像即便是同卵雙胞胎也可能在神經聯接的水平上有所不同。

通過繪製這些聯接，研究人員希望能夠理解人類大腦聯接組正常的變化，並了解大腦聯接組在人類學習、成熟和衰老過程中如何改變和修改自己。他們可以開始探究大腦聯接組在創傷性腦損傷或神經退化紊亂後如何功能失調，或者研究者Seung稱之為「聯接病例聯結（connectopathies）」的精神分裂症或自閉症患者大腦聯接組出現的機能異常。

然而，這個問題的規模之大，讓人不覺有些氣餒,目前只繪製出了一個大腦聯接組的圖譜，那就是秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）。秀麗線蟲只有300個神經元，僅形成7000種聯接，然而繪製它的神經聯接卻花費了超過10年的時間。「你的大腦聯接組（比秀麗隱桿線蟲）要大1千億倍，它的聯接比你基因組具有的字母都要多100萬倍。」Seung寫道，「基因組跟大腦聯接組相比簡直是小孩子過家家的遊戲。」

然而，研究人員試圖解決這一問題。從所謂的核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的宏觀尺度到電子顯微鏡（electron microscopy）的微觀尺度，隨著大腦聯接組逐個突觸地慢慢突破，輪廓開始清晰起來。

人腦聯接組計劃

一想到大腦聯接組，艾倫腦科學研究所研究科學高級主管曾洪奎（音譯）就想到了谷歌地圖。神經科學家想要像現代的旅行者在網上導航一樣，在虛擬空間內導航定位大腦：任意放大、縮小、搖攝，從整個大腦區域縮小到單個細胞和突觸。以這個比喻來看，曾洪奎認為宏觀的核磁共振成像技術揭示出的僅是神經超級高速公路。但她仍然覺得這個方法比較有效，正在提供「一種全局觀，讓人們了解各個區域是怎麼聯接在一起的，整個世界是如何組織建構起來的」。

這就是人腦聯接組計劃（Human Connectome Project，HCP）的中心目標。2010年9月，美國國立衛生研究院投入4000萬美元打造人腦聯接組計劃，繪製出人腦線路圖譜。人腦聯接組計劃隨之在下面建立了兩個研究小組，其中3000萬美元投入聖路易斯的華盛頓大學和明尼蘇達大學，850萬美元投入麻省總醫院（Massachusetts General Hospital）和加州大學洛杉磯分校（UCLA）。

兩個課題組都在尋求技術的進步，其中華盛頓大學和明尼蘇達大學課題組也注重於產出，他們利用一系列行為、遺傳和成像掃描的方法對1200名正常成人進行研究，其中包括400組雙胞胎及其非孿生兄弟姐妹，由此提供參考，以便其他聯接組進行比較。

兩個課題組都以自己的方式採用了核磁共振成像技術。華盛頓大學對實驗對象進行掃描，了解其解剖特徵和功能聯接性（也就是說，為共同目標而聯接起來的區域）。為了勾勒出物理聯接，該課題組使用了擴散核磁共振成像技術（Diffusion MRI），這種成像技術追蹤水分子的運動，將其作為軸突纖維定向的標記。「水分子平行於纖維時的運動比垂直於纖維時的運動要快。」麻省總醫院團隊負責人Van Wedeen這樣解釋。

Wedeen創造並使用了一種擴散核磁共振成像技術——水分子擴散頻譜造影（diffusion spectrum imaging）技術，華盛頓大學和明尼蘇達大學課題組使用高角解析度擴散成像（high-angular resolution diffusion imaging）技術。這兩個案例均想要將人腦分成數千個體積像素（也稱之為三維像素「voxels」），每個體積大約為1立方毫米，並計算每個水分子擴散時不同的方向。然後，在被稱作「纖維跟蹤成像（tractography）」或追蹤的過程中，這些向量聯接起來就產生了奪目的多彩聯接圖像或「纖維追蹤（fiber tracks）」，迂迴穿過人類的腦白質。

這樣的結果不是單個軸突，而是成千上萬個軸突總體的圖像。Wedeen說「這些只是微分方程的數值積分，而不是纖維的顯微圖像」。雖然如此，採集這些相對低解析度的數據仍然需要一些改裝升級的硬體。Wedeen說，一台標準的臨床核磁共振成像的磁場強度是3T（Tesla），梯度場強是40 mT/m。華盛頓/明尼蘇達大學課題組採用專門打造的西門子3T掃描設備，梯度強度達到100 mT/m，而麻省總醫院/加州大學洛杉磯分校課題組的「大腦聯接組掃描儀」達到300 mT/m的梯度場強。

梯度場強的提高為聯接性繪圖提供了兩個好處，Wedeen說：「你會得到更多信號和更好的信號。」就像更大的望遠鏡能夠看到更深遠的太空。

明尼蘇達大學磁共振研究中心主任，即華盛頓/明尼蘇達大學課題組共同研究員Kamil Ugurbil表示，新的掃描儀給他們的團隊帶來了「非常重要的技術進步」，解析度提高了2～3倍，其中30個實驗對象已經接受掃描，每個花費兩天的時間。

但Ugurbil已經不再使用100 mT/m 3T的掃描儀器，該儀器已經運往華盛頓大學進行項目的「產出」模式。他已經擁有了一台新的西門子7T掃描儀，應該可以提供更清晰的畫面。另外，Ugurbil正在等待一台價值1000萬美元，更大的10.5T儀器運送到位。雖然此刻，因為「全球性液氦的缺乏」，這台儀器仍然還待在工廠裡面尚未進行檢測。

Ugurbil 說：「為了冷卻這台大傢伙，我們需要4萬公升的液氦，但現在我們拿不到這麼多液氦。」

繪製中間尺度的聯接

「中觀」是美國冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory）神經科學家ParthaMitra及其同事在2009年首先提出的繪圖策略。艾倫腦科學研究所正在以這個曾洪奎所謂的「中觀」層面來繪製小鼠的大腦聯接組。為了繪製這一圖譜，曾洪奎的團隊使用了「連續的雙光子斷層攝影術」。

小鼠離散的大腦區域被注入了表達一種熒光蛋白的重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，由賓夕法尼亞大學載體中心提供）。小鼠死亡後，它們的腦區被固定並包埋在瓊脂糖中。隨後這個包埋小塊被裝進一個採用超精細切割設備或振動切片機的雙光子熒光顯微鏡內——這一系統已經被TissueVision商業化了。

在這個組合中，小塊的上表面以0.35微米的橫向解析度熒光成像，展示了由各區域被注射細胞描繪出的神經元的「軸」。然後，振動切片機切掉表面的100微米，以展現下一個表層，然後重複這一過程。

「成像、切割、成像、切割、成像、切割。」曾洪奎解釋道，整個過程是自動化的，一個大腦在18小時製作出了大約750千兆位元組（gigabytes）的原始圖像數據。而一個完整的數據集包含大約500個注射點，因此至少需要500個大腦整合併記錄到一個三維模版中進行對比和定位，從而生成詳細的、大腦水平的聯接矩陣。

曾洪奎說，從技術上來講，艾倫腦科學研究所並沒有收集「大腦聯接組」。他們的病毒是非複製型的，意味著它只能一次性感染細胞，而且它還不能穿過神經突觸。因此，她說自己的項目其實是在繪製一個「項目聯接組（projectome）」。

根據她的說法，大多數大腦區域的數據已經收集到了，有些已經公開。（這些數據可以使用該研究所的大腦瀏覽器軟體免費操作，也可以通過艾倫大腦圖譜數據門戶（ALLEN Brain Atlas data portal,www.brain-map.org）免費下載。現在曾洪奎回過頭重複整個過程，使用針對個體神經亞型的病毒，以了解諸如興奮性神經元與抑制性神經元項目聯接組之間的差別。

在冷泉港實驗室，Mitral正在採用相似的策略。他在每個小鼠的大腦中分別注射了262個網格點，但他使用了四個示蹤物——兩個「順式示蹤物」和兩個「反式示蹤物」。每個數據集大約包括1000個小鼠的大腦。

順式示蹤物中如腺相關病毒和生物素葡聚糖胺（來自美國生命技術公司（Life Technologies））首先滲透細胞體，然後「依附在順式運輸機制上的，這一機制將分子沿著軸突從（細胞體）中運至（突觸）末端」。Mitra如是解釋。反式示蹤物如霍亂毒素（來自List Biological Laboratories）和狂犬病病毒（杜克大學病毒載體中心）則通過突觸進入細胞，從軸突軸向上轉運進入細胞體，的確提供了一些遠程的聯接信息。

Mitra在浜松公司的Nanozoomer 2.0自動切片掃描熒光顯微鏡上成像每個小鼠的大腦（手動冷凍切片至20微米的切片， 40微米間隔）。重建完成後，結果數據集包含1萬億三維像素，測量一邊是1微米的。這些只是擴散核磁共振成像技術三維像素的十億分之一。他說，每個注射部位的1兆兆位元組中，他的實驗室收集了近1千萬億位元組的信息，其中有些信息將會在6月份釋放（www.brainarchitecture.org）。

微觀層面

儘管中間尺度的信息已經有一定的密度，但仍然不能真正地展示出突觸的聯接。「從嚴格意義上來說，我們並不是繪製聯接本身。」Mitra說，「來展示這裡有一個聯接，我將要向你展示的是一個突觸和穿過這個突觸的神經遞質。」

這種信息肯定無法通過中觀層面實現。但至少部分來講可以在微觀層面觀測到。以曾洪奎所說的谷歌地圖的類比來看，這就像是看到車道和人行道通往單個房子中。而看到這些細節的工具就是電子顯微鏡。

比方說，哈佛大學神經科學家JeffLichtman把400 × 400 × 250微米的丘腦切片包埋到塑性材料中（他說，這甚至不到1個功能磁共振成像三維像素），並在自製的儀器上將其切成9000個超薄切片。這個儀器基本上像一個熟食切片一樣，稱之為自動帶狀採集式超薄切片機。每個切片出現時都將其附在一條移動的帶子上，製作出像舊電影膠片一樣的大腦切片。然後，將帶子送入掃描電子顯微鏡（Lichtman使用Zeiss，FEI和JEOL的儀器），這樣就可以逐個切片成像，就像電影放映機一樣。

據Lichtman介紹，切片是以4納米解析度由16個25,000 × 25,000的像素成像，每秒可以收集2000萬像素。整個過程每天會產生1兆兆位元組的圖像數據，7天24小時不間斷，需要收集一百天。在他看來，這個項目的目的是繪製出丘腦視網膜神經節細胞的構造。「從這個數據中，我們將對視網膜信息中樞突的第一個階段有一個更好的認識。」

Lichtman最近新獲了一台電子顯微鏡，是當前數據採集速度的兩倍，每秒4000萬像素。然而，不管是從數據管理的角度來說——1立方毫米大約是1000兆兆位元組，還是從時間的角度來說——即便達到4000萬像素每秒，仍需要花費很多年來繪製1立方毫米。即使是達到這樣的速度，想要以納米級解析度繪製整個人類大腦也是完全不切實際的。

但新一代儀器可以為此提供幫助。Lichtman提到，蔡司（Zeiss）正在研發新的自動電子顯微鏡，一次可以以61個電子束（當前的機器只使用1個）繪製出切片，數據採集速度提高了大約60倍，他希望能夠在近幾年拿到這一新設備的樣機。

但數據採集只是成功的一半，德國馬丁雷德的馬普協會神經生物研究所（Max-Planck Institute of Neurobiology）MoritzHelmstaedter說，要想成功，還有一半是數據分析。

Helmstaedter作為博士後與海德堡的馬克思-普朗克協會Winfried Denk一起工作。Helmstaedter與博士後Kevin Briggman一起，使用連續斷層面電子顯微鏡來成像一片含有約1000個神經元的視網膜組織——將一塊塑性包埋的大腦切片進行成像、切割、成像、切割，類似於艾倫腦科學研究所的操作方式，但是是在納米級層面操作的。

據Helmstaedter介紹， SBEM顯微鏡連續運作了8周，採集了13000副圖像，每副圖像的大小為25億像素。（均使用了Zeiss和FEI Ems的定製超薄切片機，現在Gatan提供叫做3View的完善體系。）但卻花了超過2年的時間來再現得到的神經元迴路。

Helmstaedter對這個問題的解決方法借鑒於蛋白質摺疊遊戲FoldIt的眾包（crowdsourcing）途徑。他的團隊通過訓練電腦收集圖像，以追蹤神經突。但為了保證準確性，他們以每小時10美元的價格僱傭了200個本科生，坐在電腦前瀏覽神經突的叢林，本質上就是讓他們像用飛行模擬器一樣「在數據之間飛行穿梭」。他說，這些學生幫助團隊證實了差不多900個神經元的視網膜聯接組。

現在，Helmstaedter開始繼續加碼，提升到一片新大腦皮質的一邊有500微米，包括約10000個神經元。如果是這樣的話，他們會需要更寬廣的蜂巢智慧，他們希望可以研發這項應用移動設備上的遊戲版本。

他指出，大腦聯接組學的瓶頸是網路重建。「我們要想完成任務，必須使用這些非常手段。」

確實是徹底革新的技術。

（作者Jeffrey M. Perkel 系愛達荷州波卡特洛市的科學自由撰稿人

鳴謝：「原文由美國科學促進會（www.aaas.org）發布在2013年1月18日《科學》雜誌」。由《中國科學報社》翻譯，官方英文版請見http://www.sciencemag.org/site/products/lst_20130118.xhtml）

《科學新聞》 (科學新聞2013年第6期 科學·生命)