【指南＆共識】男性生殖遺傳學檢查專家共識

《男性生殖遺傳學檢查專家共識》 編寫組中華醫學會男科學分會遺傳學異常是臨床上導致男性不育的重要因素。隨著生殖醫學及男科學專業的發展, 很多既往認為只能供精輔助生育的患者, 如 Klinefelter 綜合征等,有可能通過睾丸顯微取精術行輔助生殖技術( ART) 助孕, 這對臨床傳統治療思路提出了挑戰;另外,新的檢測技術發展迅速,為臨床疾病病因診斷提供了強有力的手段, 但目前臨床上存在著男性生殖遺傳學檢查適應證不明確、 方法良莠不齊、 結果解讀及處理不規範等問題, 為規範男性生殖遺傳學檢查在臨床中的應用, 中華醫學會男科學分會組織專家共同研究並制定本共識, 旨在為臨床醫師提供指導和參考。1、概述遺傳學檢查在男性生殖疾病診治中的應用非常重要,開展男性生殖遺傳學檢查, 對於指導臨床治療、 提高輔助生殖技術的療效和安全性、 開展胚胎植入前遺傳學診斷( PGD) 等具有重要意義, 可選擇染色體核型分析、Y 染色體微缺失等常規檢查以及基因突變檢測等特殊檢查。遺傳學檢查技術發展突飛猛進, 許多新技術逐漸用於臨床, 如多重連接探針擴增( MLPA) 技術可檢測染色體數目異常、 基因缺失和重複等; 基因多態性分析可預測男性不育患病風險並指導個體化用藥; 精子發生過程中涉及許多表觀遺傳學調控,檢測DNA 甲基化、 組蛋白修飾和非編碼 RNA( ncRNA)等; 近年來, 具有高靈敏度、 高通量、 高解析度等特點的基因測序技術開始應用於臨床,可檢測一些基因組疾病,包括拷貝數變異( CNV) 等。比較基因組雜交( CGH) 技術可用於檢測某些不平衡的染色體畸變。這些新技術的應用將進一步豐富男性生殖遺傳學檢查內容,為臨床診斷和治療提供參考。1.1 染色體核型分析 染色體核型分析是最常用的男性生殖遺傳學檢查技術。不育男性染色體異常發生率顯著高於正常生育力男性。男方染色體核型異常,如染色體平衡易位,與不育和配偶反覆自然流產有關。20 世紀 70 年代, 高分辨 G 顯帶技術開始在臨床應用,目前已成為染色體核型分析的常規檢查方法。熒光原位雜交( FISH) 技術可用於對一些異常核型的明確診斷。1.2 Y染色體微缺失檢測 Y 染色體長臂上存在控制精子發生的基因,稱為無精子因子( azoospermia factor,AZF) ; 1996 年 Vogot 等將AZF分為AZFa、AZFb、 AZFc 3 個區域,1999年Kent等認為在 AZFb區與c區之間還存在AZFd區。AZF 的缺失或突變可能導致精子發生障礙,引起少精子症或無精子症。Y 染色體微缺失目前主要是指 AZF 缺失, 研究認為,在無精子症和少精子症的患者中,AZF 缺失者約佔3%-29%,發生率僅次於 Klinefelter 綜合征,是居於第2位的遺傳因素。目前,Y 染色體微缺失的常用檢測方法包括實時熒光定量 PCR 法、 多重 PCR-電泳法等。1.3 基因突變檢測 目前已知CFTR( cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator factor) 基因突變可引起囊性纖維化 ( cystic fibrosis, CF; OMIM219700)和先天性雙側輸精管缺如( Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens, CBAVD; OMIM277180)。此外研究還發現它與慢性胰腺炎、睾丸生精功能障礙、 精子受精功能障礙、 女性生殖能力等多種疾病相關, 甚至與腫瘤的發生、發展相關。已有研究發現存在 CFTR 基因突變的 CBAVD 患 者 ART 時有更高的流產、死胎風險。AURKC 基因突變會導致大頭多鞭毛精子症, DPY19L2 基因異常會導致圓頭精子症,雄激素受體( AR) 基因突變會引起雄激素不敏感綜合征( AIS),5α 還原酶( SRD5A) 基因突變可能會導致 46,XY 男性性發育異常等。地中海貧血是由於人類珠蛋白基因的突變引起, 包括 α 和 β 兩種類型,α 地中海貧血的胎兒,在孕中晚期易出現宮內死亡或早產後死亡等不良妊娠結局; β 地中海貧血可導致胎兒死亡或殘疾。針對廣西、廣東和海南等地中海貧血高發地區全體人群及曾生育過地中海貧血患兒的育齡夫婦, 進行地中海貧血基因突變檢測,同時配合 PGD 或其他產前診斷可預防地中海貧血患兒出生。因此, 有必要針對上述患者進行特定基因突變篩查和遺傳諮詢,指導臨床治療。2 染色體異常2.1 檢查指征及檢測方法 當精子發生異常、 性發育異常、 配偶反覆不良妊娠、體外受精-胚胎移 ( IVF-ET) 前準備以及一些特殊情形時, 通常應進行染色體核型分析, 必要時行其他遺傳學檢查。染色體分析通常使用染色體顯帶技術來進行核型分析。2.2 染色體異常類型、 臨床表型及處理策略 染色體異常通常分為數目異常和結構異常。染色體數目異常包括染色體整倍體異常、 性染色體數目異常和常染色體數目異常。男科臨床染色體數目異常以性染色體數目異常為多見, 常染色體數目異常較為少見,而染色體整倍體異常者大都出生後死亡。本共識著重介紹性染色體異常的臨床特徵及處理策略。2.2.1 Klinefelter 綜合征( Klinefelter syndrome) 的臨床特徵及處理策略 Klinefelter 綜合征也稱克氏綜合征或 XXY 綜合征,是男性患者細胞中多出 1 條X 染色體所致。多出的 X 染色體導致生精細胞發育障礙。位於 X 染色體上逃避 X 染色體的基因劑量效應可能是遺傳病理之一。Klinefelter 綜合征的常見核型為 47, XXY, 占 80%-85% , 嵌合體( 47,XXY /46, XY) 約 占 15% , 其餘為 48, XXXY、49,XXXXY等。患者通常身材高大( 與父母相比) ,第二性徵發育異常, 體征女性化, 男性乳房發育, 鬍鬚及陰毛稀少,陰莖小, 睾丸體積小, 睾酮低下和不育。可伴有多種出生缺陷, 如隱睾、 尿道下裂、 腹股溝疝、 齶裂等。成年後易發生多種合併症, 如糖尿病、 代謝綜合征、 肥胖和骨質疏鬆等。Klinefelter 綜合征的表型隨著 X 染色體數目的增加而加重, 主要表現在機體發育嚴重畸形和智力低下。Klinefelter 綜合征涉及多學科綜合治療, 主要涉及生長發育及生育治療。隨著輔助生殖技術的發展,許多 Klinefelter 綜合征患者可通過輔助生殖技術獲得子代。大多數 Klinefelter 綜合征患者臨床表現為無精子症,少數患者可表現為隱匿精子症或重度少精子症,有些嵌合比例低的個體甚至可以有幾乎正常的精子發生, 並有自然生育子代的報道。大約 40% ～ 70% 臨床表現為無精子症的非嵌合型Klinefelter 綜合征患者通過睾丸顯微取精術能獲得精子,通過體外受精-胚胎移植生育子代。已有的研究表明,Klinefelter 綜合征患者精子的異常核型從 0%-21.7% 不等,個體之間存在差異。因此,大多數的精子核型是正常的,多數患者性染色體異常的精子比例低於 5%,低於理論上的 50% 。但考慮到 Klinefelter 綜合征患者精子性染色體和常染色體異常的比例仍較正常生育人群高,其正常胚胎的比例也較正常生育組低( 54.0% vs 77.2% ),必要時建議考慮行 PGD 或產前診斷。2.2.2 47, XYY 綜合征的臨床特徵及處理策略47,XYY 綜合征患者通常身材高大, 智力正常或輕度低下,性格孤僻, 易發生攻擊行為, 生育力正常至無精子症均可發生。47,XYY 理論上可形成 4 種類型的精子( X、 Y、YY、 XY) ,但實際上異常核型精子比例很低, 通常不超過 1% ,因此臨床上通常按常規程序處理。2.2.3 染色體結構異常的分類及處理策略 常見的染色體結構異常有易位、 倒位、 缺失、 重複、 插入、環狀染色體、 雙著絲粒染色體和微結構異常等。導致染色體結構異常的遺傳學基礎是染色體的斷裂和斷裂後染色體斷端的異常重接。隨著分子細胞遺傳學技術的發展,用常規的染色方法不能或難以被發現的染色體結構異常,也能得以發現並診斷。當染色體結構異常患者產生不平衡精子時, 多數胚胎通常很難存活, 將導致流產或死胎。此類患者通常要藉助輔助生殖技術, 進行 PGD 生育子代。某些染色體結構變異患者產生精子的情況與理論值有差異,如臨床多見的 9 號染色體臂間倒位,其產生的正常核型精子比例通常較高, 但也不能完全忽視產生異常胚胎的風險。3 Y 染色體微缺失3. 1 Y 染色體微缺失篩查指征、 檢測位點及方法Y 染色體微缺失目前主要是指 AZF 微缺失。Y 染色體上影響精子發生的 AZF 區域, 可分為 AZFa,AZFb,AZFc 等區域。非梗阻性無精子症、 嚴重少精子症患者,建議進行 Y 染色體微缺失檢測。原因不明的男性不育患者可選擇性行 Y 染色體微缺失檢測。AZF 微缺失能垂直遺傳,有相關家族史者,建議進行篩查。目前,檢測 AZF 微缺失推薦以下 8 個位點為包含位點。sY84 及 sY86、sY127 及 sY134、sY254 及sY255、 sY145 及 sY152。以前 Y 染色體 AZF 微缺失的臨床實驗室診斷方法是利用外周血標本行多重 PCR-電泳法, 該技術耗時長,結果判定的主觀性大,還存在交叉污染的風險。隨著技術的進展, 建議應用實時熒光定量 PCR技術,靈敏度高、 特異性好、 檢測速度快, 同時, 必須加強臨床檢驗過程中的質量控制。3.2 Y 染色體微缺失的臨床處理策略3.2.1 AZFa 區域缺失 通常導致唯支持細胞綜合征( SCOS) ,臨床表現為睾丸體積的縮小、 無精子症等。AZFa 區域完全缺失合併無精子症者,建議供精人工授精( artificial insemination by donor,AID) 。3.2.2 AZFb 區域缺失 患者睾丸組織病理學表現為精子發生阻滯, 主要停留在精母細胞階段, AZFb+ c 缺失會導致 SCOS 或精子發生阻滯,患者多為無精子症,故 AZFb 完全缺失( 含 AZFb + c 缺失) 的無精子症者,建議供精 AID。3.2.3 AZFc 區域缺失 單獨 AZFc 缺失患者可以表現為正常精子數目、 少精子症及無精子症, AZFc微缺失可以遺傳給其男性後代。對於 AZFc 區缺失的無精子症患者,可以行睾丸手術取精獲得精子行ICSI。對於 AZFc 區缺失合併嚴重少精子症患者, 可以直接 ICSI,助孕時建議行 PGD 生育女孩, 以避免遺傳缺陷的垂直傳播。另外, 有研究發現 AZFc 區域缺失的少精子症患者, 其精子數目有進行性下降的趨勢,最後發展為無精子症。因此,對此類患者建議及早生育或冷凍保存精子。3.2.4 sY145 及 sY152 有研究報道 sY145 及 sY152可能與精子形態異常相關,缺失可能導致少精子症或者精子形態異常。但目前尚缺乏國人大樣本( 包括正常生育人群及無精子症患者) 的研究數據,故sY145 及 sY152 的臨床意義尚需進一步研究, 建議參考已發表的相關文獻,對該位點與臨床表型之間的關係及相應的睾丸組織病理學特徵進行深入研究,為男性不育患者提供更加全面的遺傳學診斷。4 CFTR 基因檢測4.1 CFTR 基因突變檢測指征 CBAVD 是男性不育和梗阻性無精子症的重要原因, 患者除自覺精液量少之外多無其他癥狀, 精液化驗精液量少,pH 值低( ＜ 6． 4) ,精漿果糖陰性, 彩超多提示附睾網格狀回聲、附睾發育不良、雙側精囊腺發育不良等, 少數病例合併腎臟發育畸形或缺如。對於存在以上情況疑診 CBAVD 的患者建議進行 CFTR 基因檢測。4．2 CFTR 基因檢測方法 目前已知的 CFTR 基因突變有 2 000 多種, 並且還在不斷增加［ 31］ 。理想的突變檢測方式是採集外周血對整個 CFTR 基因( 包括啟動子區) 進行測序。但限於目前還缺乏中國人群大樣本的研究數據,建議可以先從已知突變位點著手開展,未來再藉助高通量測序的方法更為全面、 有效地檢測出基因突變和多態性位點。4．3 CFTR 基因突變處理策略 如果男方存在CFTR 基因突變,建議進行遺傳諮詢, 避免子代的遺傳學風險。5 精子 DNA 完整性檢測精子 DNA 完整性是親代將遺傳物質正確傳遞給子代的前提,在受精和胚胎髮育過程中發揮重要作用。精子 DNA 完整性檢測反應了精子 DNA 的損傷程度, 研究表明精子 DNA 的損傷與男性不育、 自然妊娠率的降低和反覆流產可能有關。臨床上引起精子 DNA 損傷的主要病因包括①精索靜脈曲張、 睾丸炎、 附睾炎和生殖器腫瘤等疾病; ②激素、放、 化療藥物及免疫抑製劑等藥物的使用; ③抽煙、酗酒等不良生活習慣及農藥、 重金屬等環境污染物;④年齡或心理因素等。5．1 精子 DNA 完整性檢測的適應證 ①女方反覆自然流產、 胚 胎 停 育 等 的 男 性 不 育 患 者; ② 採用ART 多次未成功的男性不育患者; ③排除女方因素的特發性男性不育患者( 無精子症除外) 推薦進行;④大齡、擬行 ART 助孕者及育前優生體檢者可選擇性檢查。5．2 精子 DNA 完整性檢測方法 由於目前檢測方法較多,且各有優劣。常見技術包括精子染色質結構分析試驗 ( SCSA) 、 彗星試驗 /單細胞凝膠電泳( SCGE) 和精子染色質擴散試驗( SCD) 、 熒光原位雜交技術( FISH) 等。SCSA 法成本相對較高, 且需要使用流式細胞儀檢測,對實驗室條件要求較高,但檢測中分析5 000條精子,能更加穩定準確地反映精子 DNA 損傷的真實狀態; SCD 法只需使用光學顯微鏡,檢測快速且成本相對較低,但檢測結果易受主觀分析影響, 檢測人員的經驗和熟練程度尤為重要。目前使用流式細胞儀進行 SCSA 法使用相對較多。5．3 精子 DNA 完整性檢測的結果解讀目前SCSA、 FISH 及 SCD 等方法使用相對較多。對於精子 DNA 完整性檢測的結果上, 使用精子 DNA 碎片指數( sperm DNA fragmentation index, DFI) 高低來表示,目前一般認為: DFI≤15% 為正常,15% ＜ DFI＜ 30% 為一般,若 DFI≥30% 認為完整性較差, 可能會影響妊娠結局。5．4 精子 DNA 完整性檢測結果的臨床處理策略針對高 DFI 患者,建議其改善不良生活習慣,避免接觸吸煙、 酗酒、 藥物等生殖毒性物質和桑拿等過高熱環境; 服用抗氧化劑, 如維生素的補充; 如有感染進行抗感染治療; 針對病因的手術治療,如精索靜脈曲張結紮術等。總之,男性生殖遺傳學檢查對於指導臨床診療有重要意義,生殖遺傳學檢查的指征及處理策略需要在臨床中進一步規範及完善, 儘管還存在不同學術觀點,但隨著檢測技術飛速發展及更多臨床研究的開展,生殖遺傳學檢查在男科領域內的應用將更為規範。
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