畸形精子超微結構觀察的研究與應用進展

王家雄綜述；史軼超，楊慎敏審校(南京醫科大學附屬蘇州市立醫院生殖遺傳中心, 江蘇蘇州 215002）

【摘要】精子超微結構畸形往往與精子的活力、遺傳物質完整性、受精潛能息息相關，而其觀察離不開顯微技術的不斷變革。本文通過介紹精子形態學觀察中顯微技術的發展，並描述顯微技術在精子各部位常見畸形以及凋亡生精細胞超微結構觀察方面的應用，來闡述其在如今臨床工作中的重要性。對於一些特殊的畸形精子症患者，在分析病因和採取輔助生殖手段之前，對其精子的超微結構進行分析是有必要的。 【關鍵詞】精子形態；畸形精子症；超微結構

世界範圍內約有15%的夫婦存在著不孕不育問題，而其中男性的原因佔20%~50%。很多情況下男性不育與精子畸形存在著一定的聯繫，臨床上有些精子形態檢測僅僅依靠光學顯微鏡觀察無法徹底詮釋與診斷，電子顯微鏡技術在畸形精子的超微結構研究中發揮了重要作用。對於臨床常見的一些病症，如不動精子症，其病因可能是由於精子的超微結構異常造成，這時傳統光鏡觀察顯得乏力，而電鏡觀察卻可以確定其病變特點以明確診斷。對於一些更為少見的系統性超微結構異常，如頭尾分離精子、無頭精子等，精準的超微結構分析可以協助判斷病變的遺傳基礎。精子的超微結構不僅決定了精子的運動情況，也與輔助生殖結局息息相關，不同超微結構異常的患者輔助生殖結局存在差異，對特殊畸形在術前進行超微結構分析可以幫助預測輔助生殖的成功率，指導醫生和患者做出治療選擇［1］。本文對精子形態觀察中顯微技術的發展與常見畸形的超微結構綜述如下。

1精子形態學觀察技術

傳統的精子形態觀察由於光學顯微鏡解析度的局限而無法區別一些相近的畸形精子，而且無法解釋畸形精子的具體結構缺陷。電子顯微鏡相比光學顯微鏡，除了可以定性地檢測精子內部極細微的異常，還可以直接從屏幕準確定量。儘管電子顯微技術發明至今已有數十年，然而到目前為止，對精子超微結構的認識仍是基於傳統電鏡的觀察。Chemes等［2］認為超微結構觀察為一些特殊的畸形精子症的發生提供了結構基礎，從而為之後的分子生物學分析和基因學研究打開了一扇大門。如今，透射電鏡結合免疫膠體金技術而產生的免疫電鏡，可以對精子膜表面上的各種受體和跨膜蛋白進行定位和初步的定量［3］。 在傳統電子顯微鏡技術出現之後，光子掃描隧道顯微鏡(photon scanning tunneling microscope， PSTM)又逐漸發展起來，它具有納米級三維分辨能力，成為光學顯微鏡的重大突破。以後，又陸續發展了一系列工作原理相似的新型顯微技術，包括原子力顯微鏡(atomic force microscope， AM)、橫向力顯微鏡(lateral force microscope， LFM)等。以往傳統的電子顯微鏡技術需要將樣本固定、脫水甚至包埋與切片，但是對於原子力顯微鏡，這種技術允許觀察未受損精子的超微結構。此外，它可以讓圖像三維重建和增強對比度來觀察細節，例如包圍軸絲的精子中段線粒體［4］。在精子超微結構觀察中，X射線顯微鏡的樣品製備與常規光學顯微鏡一樣，但解析度能高達30 nm；在液體介質中觀察，標本不需要固定、染色或金屬塗覆，這些特點使X射線顯微術成為有效的細胞尤其是細胞懸液的研究手段。Vorup-Jensen等［5］利用X射線顯微術的這一優點，觀察了精子獲能過程中線粒體的超微結構變化。 一直以來，由於遠場光學成像技術固有的衍射限制，導致可見光光學顯微鏡(包括普通熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡)的解析度有限，隨著高解析度熒光染料和單分子光譜技術的不斷推陳出新，高解析度光學顯微技術（high resolution light microscopy, HRLM）在細胞超微結構的觀察和研究中得到了廣泛應用。Chung等［6］利用HRLM在哺乳動物的精子中發現了鈣通道蛋白CatSper，它定位在沿著精子鞭毛的4個線狀信使分子的組織域內，是精子正常遷移功能所必須的蛋白。人工授精時，精子頭部的空泡等細微異常會直接影響受精的成功與否，普通的光學顯微方法無法達到觀察要求，為了克服傳統光鏡的這個缺陷，Bartoov等［7］發明了活動精子細胞器形態學檢查（motile sperm organelle morphology examination， MSOME)，精子DNA高度碎片化或者完全圓頭精子症的患者，可以通過MSOME嚴格選擇形態好的精子進行胞質內形態選擇單精子注射（intracytoplasmic morphologically selected sperminjection， IMSI）,大大提高其輔助生殖的成功率。該技術不僅克服了傳統精子質量評估方法，如掃描電鏡、熒光原位雜交、精子染色質結構分析等在ICSI中無法同時進行的缺點，同時避免了在常規 ICSI 過程中對精子核細微形態學異常無法觀察的不足。

2超微結構顯微技術在常見畸形精子觀察中的應用

由於超微結構觀察不僅在解析度上優於傳統光學顯微鏡，而且電腦科技的推陳出新也讓電子顯微鏡可以進行定量觀察。如今，超微結構觀察不僅僅可以用於精子亞細胞結構的形態學評估，還可以對精子各部位畸形進行定量分析。2.1頭部畸形 精子頭部畸形是常規形態分析中最常見的類型，頭部形狀、空泡情況和頂體狀態與妊娠結局息息相關。國外有研究表明，利用光學顯微鏡觀察頭部形態、頂體大小、頂體空泡狀況並結合頂體反應實驗，對體外受精(in vitro fertilization, IVF)的受精率有非常高的預測能力［8］，可見對精子頭部形態的分析至關重要，而對於頭部畸形的結構基礎以及細微異常的觀察非常依賴電子顯微技術的參與。2.1.1圓頭精子症 圓頭精子症可以分為完全圓頭精子症和部分圓頭精子症，通過電子顯微鏡觀察可以準確地對其進行細分。Alvarez Sedó等［9］通過超微結構研究圓頭精子的發生過程，發現正常精子的早期頂體來源於高爾基體里初級頂體囊泡的融合，在這個階段，核被膜與頂體接觸的部分出現各種修飾，使頂體囊泡最後形成成熟頂體。而對於完全圓頭精子症的精子，高爾基體初期衍生出小而非典型的多泡、多層結構，這些結構後期要麼無法成熟，要麼無法依附於核被膜而進入胞質殘餘體。與完全圓頭精子症不同的是，部分圓頭精子症的精子頭部除了傳統的圓形外，還存在很多橢圓形，伴隨著核膜的異常與線粒體出現核內分布［10］。2.1.2頭部空泡精子頭部空泡在正常男性精子中也會出現，但是當空泡過多的精子大量存在時就會伴隨著患者精子質量下降和不育。Zhang等［11］在關於罕見的100%空泡精子的病例報道中提出，儘管光學顯微鏡可以應付常規的精子形態觀察，然而對於精子空泡異常的觀察，電子顯微鏡是一個十分有效的工具。Fekonja等［12］的研究發現很多空泡中都有著漩渦樣的膜結構，而與以往的研究不同的是，他們認為現有的研究無法證明空泡是精子發生錯誤導致的，精子頭部空泡可能是一個獨立結構。2.1.3核異常精子細胞核里包含的遺傳信息對於精子的作用至關重要，上世紀人們意識到精子形態可以反映精子質量，但是光學顯微鏡無法看清精子細胞核的細微異常，而電子顯微鏡是精子核超微結構觀察的有效工具。Skowronek等［13］研究了DNA損傷與精子核超微結構的關係，發現精子核內染色質超微結構與DNA損傷相關，大量染色質如果聚集在核膜附近有可能預示著精子的凋亡。Franco等［14］認為核區域的空泡也提示著染色質纖維的過早解聚，影響染色質的包裝，並與DNA損傷有關，這會影響輔助生殖結局，所以他認為在對嚴重畸形精子症患者進行單精子注射之前，進行高解析度的形態學篩選是必要的。2.2頸部畸形頸部是頭尾的連接處，也是精子動力的來源，頸部線粒體畸形會嚴重影響精子的運動。對於頭尾連接異常的精子，IVF成功率極低，很多患者不得不採取ICSI。但是有研究表明，並非所有的精子頭尾連接異常患者都可以通過ICSI成功受孕，正常中心粒的存在與否起到了決定性作用。由於傳統的光學顯微鏡只能看清表觀，而無法探究內在結構，所以超微結構觀察對於頸部異常，尤其是頭尾連接異常的診斷十分必要［15］。2.2.1頸部線粒體異常在平時檢驗工作中，實驗人員會發現很多精子頸部異常粗，但在光學顯微鏡下並不清楚其細微的結構。研究者在電子顯微鏡的幫助下，發現頸部異常粗的精子表現為頸部膨大、粗短，線粒體囊性擴張，微管消失［16］。Mundy等［17］的研究發現，弱精子症患者精子頸部線粒體明顯少於正常對照，他們認為，頸部形成之前，線粒體被胞質包圍，而後胞質脫離，線粒體遷移形成正常的頸部；而對於弱精子症患者，其精子線粒體有一部分可能隨著胞質一起脫離，導致頸部線粒體數目異常。雖然精子頸部細胞器組裝分配的機制還尚未了解，但是Olson等［18］的研究發現精子頸部線粒體與頸部特殊的細胞骨架結構之間存在橋狀連接，這為解釋精子頸部線粒體遷移組裝提供了超微結構的證據。2.2.2頭尾連接異常精子的頭尾連接異常包括很多現象，這些異常與精子頸部與尾部的細胞骨架有關。通過光學顯微鏡只能看到精子中段的表觀異常，而通過電子顯微鏡觀察可以發現，這些精子的中段不僅出現了插入角度異常、組裝異常、線粒體排列異常，在一些特殊病例中精子甚至出現植入窩和基底板從細胞核中分離，頭和尾之間的解離十分明顯。Moretti等［19］認為通過超活體染色技術，利用透射電鏡觀察核膜完整性、頂體是否激活和精子染色質是否凝聚來確定精子的存活程度十分有效。 無頭精子是頭尾連接異常的一種特殊現象，通常認為其發病機制是精子頭部的發育異常，與精子頭部和頸部連接異常並無關係。然而通過對於無頭精子的超微結構進行分析，Chemes等［20］發現患者的睾丸中也存在包含高爾基體的精子頭部，之後頭部與尾部的軸絲分別發育卻並未連接在一起，精子星狀體形成異常，引起了中心粒缺陷，最後導致了精子頭部的脫離並最後消失。2.3尾部畸形精子尾是負責精子運動的結構，嚴重的尾部畸形往往導致精子運動障礙，同時也會導致IVF的失敗率升高。Malgorzata等［21］在IVF失敗組精子中發現，其尾部超微結構畸形顯著多於成功組，他們認為IVF失敗的夫婦在採取ICSI之前，對男方精子進行系統性的透射電鏡檢查是有必要的。 尾部異常中的纖維鞘發育不良（dysplasia of the fibrous sheath， DFS），其精子會出現纖維鞘增生變厚，伴隨著尾部環狀結構的缺失，50%出現中心微管和動力蛋白臂的缺失［22］。我們實驗室對短尾精子DFS進行了超微結構與基因檢測，掃描電鏡下清晰地觀察到精子尾部畸形，部分精子尾部僅存末段樣的結構；而在透射電鏡下，可以見到精子尾部組裝異常，精子纖維鞘以及線粒體等細胞器未能在正常的位置完成組裝，而是紊亂地堆積在精子尾部；橫斷面可見精子纖維鞘明顯增厚，大部分精子中心微管缺失；有的病例動力蛋白臂缺失，而有的卻可觀察到正常的動力蛋白臂［23-24］。雖然顯微技術層出不窮，但是現在用於診斷DFS最可靠的形態學手段還是透射電鏡。 精子尾部的外圍微管上分布著成對的動力臂，而對於原發性纖毛運動障礙（primary ciliary dyskinesia， PCD)患者動力臂缺陷是最常見的病理改變,大約佔 70%~80%，這導致精子尾部動力的嚴重不足［25］。PCD患者精子除了動力臂缺失之外，還有中心微管消失、放射輻異常、纖毛或鞭毛無中心管及軸系等結構異常，一般來說這些缺陷均可導致精子完全喪失運動能力。這些異常在光鏡下難以發現，這是因為光學顯微鏡觀察的都是精子尾部的表觀，而利用透射電鏡觀察精子尾部橫斷面就可以清楚地看到中央軸絲的缺失、微管的排列異常以及動力臂的缺失［26］。2.4非特異性精子畸形超微結構異常包括系統性的結構異常和非特異性結構異常，前者可由於遺傳學異常引起，而後者往往由於多種後天性因素導致。非特異性精子畸形往往與患有特殊疾病和服用特殊藥物有關，許龍根等［27］發現尿毒症患者的精子在電子顯微鏡下觀察，畸形率大大高於光學顯微鏡觀察，患者的精子在頂體存在病變的同時核內也出現大量空泡，伴隨著部分精子的頭尾分離與尾部多種畸形［27］。精索靜脈曲張是男科臨床常見的疾病，患者精子常出現狹長頭部，這可能與該病症引起的迴流壓力有關。通過透射電鏡觀察，馬華剛等［28］發現精索靜脈曲張患者最常見的精子超微結構異常是在頸部存在胞質殘餘體，其中包裹了不規則環狀排列的電子密度高低不等的物質，而精子頭部多為銳角三角形，頭部較長，連接段多發生分隔和異常。藥物的作用也可以導致精子超微結構的變化，在治療潰瘍性結腸炎時，所用藥物如柳氮磺胺吡啶，會導致精子出現巨大頭部，停葯後恢復，採用電子顯微鏡觀察後發現藥物引起的精子頭部巨大化可能與精子核在藥物作用後出現自發解聚有關［29］。2.5生精細胞凋亡在不育患者的精液中，凋亡的生精細胞十分常見。導致生精細胞凋亡的因素是多種多樣的，Sakallioglu等［30］研究發現，在燒傷的大鼠睾丸中，凋亡生精細胞增多，它們具有高電子密度的核結構，胞質中內質網體積變大，細胞外基質蛋白增多。Hussein等［31］發現經過X射線大劑量輻射後的小鼠睾丸中生精細胞出現凋亡的明顯特徵，出現了不規則的細胞核和密集的染色質聚集，電子緻密的胞質被分裂於附近大量的凋亡小體中。除此之外，精索靜脈曲張、隱睾、艾滋病甚至睾丸的惡性腫瘤等均可以引發生精細胞凋亡。印洪林等［32］發現生精細胞的凋亡是一個連續的過程，凋亡的生精細胞核會在核膜下或核膜間形成囊泡，隨後核膜膨脹摺疊並融合成花環狀結構，最終形成凋亡小體和殘餘體，被組織細胞或粒細胞吞噬，他們認為對生精細胞的超微結構進行分析, 對生精細胞凋亡導致弱精子症的診斷和治療具有重要價值。Sardi-Segovia等［33］利用透射電鏡觀察人類凋亡生精細胞的形態也發現了類似的現象，凋亡生精細胞中，核變形並伴隨空泡化，染色質呈半月形且分散，而細胞質則表現出空泡化、胞質突起，出現嗜鋨性板層小體，線粒體和內質網腫大，作者認為生精細胞凋亡的超微結構觀察結合DNA碎片研究，可以來預測男性不育患者從少精子症到無精子症的過渡。2.6精子形態的定量檢測電子顯微鏡由於電腦技術的介入和超高的解析度，使得其在定量分析方面也有十分突出的作用。早在上世紀定量超微形態學精子分析的長處就已被研究者們所認知，這種定量分析的方法結合掃描電鏡和透射電鏡，對精子7個重要部分（頂體、頂體後緻密板、細胞核、頸部、軸絲、線粒體鞘和外層緻密纖維）進行超微結構定量分析，並創建了一套評價體系，這種方法為特定的非標準體外干預治療建立了一套標準，其中包括精索靜脈曲張手術、FSH給葯和針灸治療等［34］。Pei等［35］對於受過針灸治療的特發性不育症男性的精子進行超微結構觀察並進行定量分析，發現通過針灸，患者精液中超微結構正常的精子顯著增多，作者發現通過透射電鏡可以準確測量精子超微結構的數據，並對正常結構進行計數，在這次實驗中，針灸組較對照組精子頂體位置和形狀、精子核的形狀、軸絲的排列和形狀以及附加纖維都更正常，然而對於一些特定病理的精子，如凋亡精子數量，針灸並沒有改善。

3結語

在臨床，超微結構觀察的應用已逐步引入，對於腎病的超微結構診斷在臨床早已應用多年。而對於不育男性，尤其是無精子症患者的睾丸活檢，超微結構觀察也在逐漸彌補傳統病理學觀察的不足，為臨床判斷病因提供更多證據。如今，越來越多的科技手段可以幫我們更好地了解畸形精子的超微結構基礎，結合分子生物學研究可以進行追根溯源的分析，來了解各種畸形精子症的發病機制和基因根源。我們認為在對一些特殊精子畸形進行診斷和進一步採取輔助生殖手段之前，進行超微結構分析或者進行形態學篩選十分必要。超微結構觀察由於操作繁瑣和成本偏高，在各個醫院開展的並不多，下一步是如何讓超微結構觀察為臨床診斷與治療提供更為簡便、可靠的依據。

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