「攪局者」——CRISPR技術

來源 生命奧秘

編譯 Eason

原文檢索：

Heidi Ledford. (2015) CRISPR， THE DISRUPTOR. Nature， 522：20-24.

繼PCR技術之後的史上最強基因編輯技術將給生命科學帶來巨大的改變，但是人們的擔心也隨之而來。

3年前，美國加利福尼亞州舊金山市Gladstone研究所（Gladstone Institutes in San Francisco， California）的遺傳學家Bruce Conklin想到了一個能夠改變他們實驗室工作流程的新辦法。Conklin的研究方向是DNA變異與人類疾病的關係，但是他感覺他們的實驗方法和流程非常的複雜，而且不管用。比如他們在對患者的細胞進行研究時就很難確定哪些序列與疾病有關，哪些信號是背景雜訊。往細胞里引入一個突變也是既費時、費力，又費錢的一項大工程。「改造一個基因就是我們一個研究生的課題。」Conklin介紹說。

2012年，Conklin看到了一篇剛剛發表的，介紹CRISPR技術的文章。使用這種技術，可以快速對DNA進行改造，而且幾乎不受物種的限制，當然也能夠對人類的DNA進行遺傳學改造。Conklin很快就放棄了他們之前的研究策略——構造病理模型，轉向了CRISPR這種新技術。Conklin等人正在對一系列與心臟疾病有關的基因進行改造，他興奮地指出，CRISPR技術給我們帶來了徹底的改變。

很多人都有著與Conklin一樣的感受，大家都認為CRISPR技術正在給生物醫學研究帶來一場巨大的改變。與其它基因編輯技術（gene-editing methods）不同的是，CRISPR技術更便宜、更便捷，所以出現之後立即席捲全球。科研人員們希望用這種技術對人類的基因進行改造，以達到治療疾病的目的，同時也希望使用這種技術創造出抗病、抗蟲等抵抗力更強的植物，以及其它很多新的用途。美國紐約康奈爾大學（Cornell University in Ithaca， New York）的遺傳學家John Schimenti表示，自從踏入科學的殿堂以來，他親身經歷過兩大科技進步，那就是PCR技術和CRISPR技術。PCR技術是誕生於1985年的一項基因擴增技術，它給遺傳工程學帶來了革命性的改變。CRISPR技術也和PCR技術一樣，正在從方方面面影響著生命科學的發展。

雖然CRISPR技術有著諸多的益處，但是也有一些科學家對此表示擔憂。他們擔心科技發展太快，而與此相關的倫理和安全問題卻沒能跟上，所以有可能帶來問題。比如今年4月，CRISPR技術就受到了公眾的關注，因為有科學家使用這種技術對人體胚胎進行了改造（Nature 520， 593–595； 2015）。這個經過改造的胚胎是一個不能發育為完整生命體的胚胎，但是儘管如此，該消息還是引起了熱烈的討論，討論的焦點就是究竟能否使用CRISPR技術對人類基因組進行可遺傳的改造。除此之外，還有一些其它的擔憂。比如有些科學家就希望看到更多的研究，以驗證CRISPR技術是否會給基因組帶來非目的性的、其它的、有可能存在風險的改變。再比如美國加利福尼州斯坦福大學（Stanford University in California）的系統生物學家Stanley Qi就認為，CRISPR技術的門檻非常低，任何實驗室都能夠掌握這項技術，既不需要耗費巨資購置實驗設備，也不需要對實驗人員進行長達數年的培訓。所以我們應該好好想想，怎樣才能更好地使用這項新技術。

一直以來，生物學家們都能夠應用各種分子生物學技術，對基因組進行編輯操作。大概在十年前，出現了鋅指核酸酶（zinc finger nucleases），它能夠以很高的準確度和效率進行基因組編輯，所以科研人員也為此興奮了好一陣。但是據美國馬薩諸塞州布蘭迪斯大學（Brandeis University in Waltham， Massachusetts）的分子生物學家James Haber介紹，動輒5000美元甚至更高的價格卻讓人難以接近，而且還需要定製與靶標相適應的鋅指核酸酶，非常麻煩。而CRISPR技術就不一樣了，該技術只需要使用Cas9酶，能夠識別靶標DNA的嚮導RNA（guide RNA）就足夠了。CRISPR技術能夠對DNA序列進行編輯，起到破壞基因，或者插入外源序列的作用。科研人員們需要做的往往只是訂購一段嚮導RNA，因為其他的實驗材料都是通用的，而總成本也才只需要30美元。據Haber介紹，這種特點使得每一個人都能夠用上CRISPR技術，這就是一場巨大的科技革命。

CRISPR技術問世之後立即取代了鋅指核酸酶和其它一些基因組編輯技術。對於某些人來說，這意味著他們之前花費了很多年才掌握的技術一下子變得毫無價值，所以不得不放棄那些技術。英國Wellcome基金會Sanger研究所（Wellcome Trust Sanger Institute in Hinxton， UK）的遺傳學家Bill Skarnes就說道：「我很沮喪，但我同時也感到非常興奮。」在Skarnes的科研生涯當中，有絕大部分時間都使用的是上世紀80年代中期發展起來的一種技術，即在胚胎幹細胞里插入一段DNA，然後用這些細胞培育出轉基因小鼠的技術。該技術已經成為了實驗室里的主流技術，但它確實費時費力，而且價格昂貴。相比之下，CRISPR技術就要省事得多，Skarnes的實驗室也在兩年前開始使用CRISPR技術。

科研人員在科研工作當中一直都非常依賴果蠅和小鼠等模式生物，有一部分原因就是因為我們只能夠對這些模式生物進行遺傳學改造。現在有了CRISPR技術，我們就能夠對更多的生物進行改造。比如在今年4月，美國馬薩諸塞州坎布里奇Whitehead生物醫學研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge， Massachusetts）的科研人員就使用CRISPR技術對白色念珠菌（Candida albicans）這種對免疫力低下人群致命的真菌進行了研究，要知道在過去是很難在實驗室里對這種生物進行遺傳學操作的。美國加州大學伯克利分校（University of California， Berkeley）的CRISPR技術先驅Jennifer Doudna一直在更新她的CRISPR技術適用範圍表。到目前為止，她的這份表格里已經登記了30多種物種，全都是可以用CRISPR技術進行改造的，其中就包括致病的錐蟲（trypanosomes）可以用來製備生物燃料的酵母。

不過CRISPR技術這種飛速的發展也帶來了一定的問題。美國加州大學舊金山分校（University of California， San Francisco）的生物物理學家Bo Huang就表示，大家都還沒有足夠的時間來確定整個技術系統的基本參數。大家都認為，只要這種技術管用，我們就沒必要知道它為什麼管用，以及這種技術的工作原理。這就意味著科研人員需要時不時地面對一點干擾信號。Huang等人在實驗室花了兩個月的時間，想將CRISPR技術引入成像研究工作當中。他們認為，如果能夠更清楚地了解應該如何優化嚮導RNA的設計（即基礎原理），他們是不會在前面浪費這兩個月的時間的。

但是總體而言，科研人員們都願意接受這種「無知」的代價，因為CRISPR技術實在是太好用了。不過Doudna則更關注安全問題。她的擔憂源自2014年召開的一場會議，當時她參加了一個博士後的工作分享，這名科研人員構建了一個攜帶有小鼠CRISPR組份的病毒。小鼠吸入這種病毒之後，病毒中攜帶的CRISPR組份就開始表達並發揮作用，對小鼠的基因組進行了改造，成功地構建出人肺癌小鼠動物模型。當時Doudna就感到了一陣恐懼，因為這個病毒攜帶的嚮導RNA如果出了一點問題，那可能就不是讓小鼠患上肺癌，而是讓我們人類患上肺癌了。Doudna說道：「讓學生開展這種實驗可真夠嚇人的。我們一定得讓大家知道，應該用CRISPR技術來幹些什麼。」

Andrea Ventura是美國紐約紀念斯隆-凱特林癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center in New York）的一名腫瘤研究人員，同時也是上述小鼠實驗工作的主要負責人，他表示，他們實驗室非常認真、仔細地考慮過了整個實驗的安全性問題，他們設計的嚮導RNA是特異性、專一性針對小鼠基因組的，而且病毒也都是失活的，不能進行複製。Ventura也認為應該對這項研究的遠期風險進行預判和評估，他說道：「雖然我們設計的嚮導RNA不會影響人體的DNA，但是誰知道呢。雖然不太可能，但這個問題還是值得考慮。」

去年，美國麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology in Cambridge）的生物工程師Daniel Anderson等人使用CRISPR技術在小鼠動物實驗中成功地糾正了一種與人高酪胺酸血症（tyrosinaemia）相關的遺傳突變。這也是世界上首次使用CRISPR技術在成年動物實驗中糾正了致病突變，這預示著我們在使用CRISPR技術進行基因治療的道路上又向前邁進了一大步。

CRISPR技術能夠加快基因治療的消息也讓科研界和生物技術界興奮不已。不過雖然這種技術的潛力很大，但Anderson的研究也向我們展現了，現實與理想的差距有多遠。為了將Cas9酶和嚮導RNA注入小鼠的靶器官肝臟，Anderson等人往小鼠的血管中注入了大量的液體，如果是對於人體，這種方法根本就是行不通的。而且在他們的實驗中，只有0.4%的細胞里的致病突變得到了糾正，這對於治療疾病來說是遠遠不夠的。

近兩年來，有很多公司都加入了用CRISPR技術開展基因治療的行列。據Anderson等人估計，最快將在一兩年內會有產品進入臨床試驗階段。這些實驗可能會將CRISPR藥物直接注入靶器官，比如眼睛等，也可能會植入取自患者自身的細胞里，然後將這些經過改造的細胞回輸到患者體內。比如對患者的造血幹細胞進行改造，來治療鐮狀紅細胞病（sickle-cell disease）或β地中海貧血（β-thalassaemia）等疾病。不過我們可能很難將CRISPR藥物直接注入其它靶器官，但科研人員們希望，在未來的某一天，能夠使用這種技術解決各種各樣的遺傳疾病。

很多科學家都認為，我們還需要開展更多的工作，保證CRISPR技術的安全和功效。比如增強該技術的基因組編輯能力，但同時也不能夠在非目標區域內引入改變，避免對人體健康造成影響。Haber表示，這些酶如果在目標區域之外發揮了作用，就會帶來一系列的後果。如果你想替代某人幹細胞內的鐮刀狀細胞基因，那麼你就該先問問，『會不會同時在它的基因組內造成其它的影響和改變呢？』」

Keith Joung在美國麻省總醫院（Massachusetts General Hospital in Boston）從事基因編輯研究，他也一直在開發能夠找到Cas9脫靶切割位點的方法。據Joung介紹，這種脫靶切割發生的幾率在每種細胞之間都大不一樣，甚至不同的序列都有所不同，他們實驗室和其他幾個實驗室觀察到的脫靶位點突變率的範圍從0.1%一直到超過60%。即便是極低概率的事件也有可能帶來潛在的危害，比如就有可能加快細胞的生長和增殖，形成腫瘤。

美國馬薩諸塞州坎布里奇專門從事CRISPR基因治療的Editas公司的CEO Katrine Bosley認為，既然還存在這麼多的問題，所以就更加應該對CRISPR技術進行嚴格的監控。Bosley在新技術商業化方面有著豐富的經驗，據她介紹，在新技術商業化推廣的過程中，最困難的一步就是說服其他人相信這種新技術有作用。她說道：「關於CRISPR技術，幾乎全是它的各種好處，大家都非常激動，也都給予了很大的支持，但是是否真能讓大家的期望變成現實，關於這個問題我們還得冷靜一點。」

CRISPR技術在農業方面的應用

就在Anderson等人將目光鎖定在如何利用CRISPR技術改造人體細胞的時候，另外一部分人則瞄準了莊稼和家畜。在基因編輯技術出現之前，我們的做法就是往這些農牧業生產對象的基因組裡「隨意地」插入一個基因（不能確定並控制基因插入的位置），然後利用一段來自細菌、病毒或其它物種的調控序列，促進該外源基因的表達。但是這種遺傳學改造的效率是非常低的，也常常會引起反對人士的抗議，這幫人不願意將不同物種的DNA混在一起，他們擔心這種隨意的插入會影響被插入基因組裡其它基因的功能。此外，這種經過遺傳學改造的農作物的商業化上市過程也非常複雜，而且費用不菲，所以也僅限於對玉米或大豆這種需求量非常大的作物進行遺傳學改造。

有了CRISPR技術之後，這種現狀將得到很大的改變，由於CRISPR技術具有低成本和易用性的特點，所以能夠對生產規模很小的特殊農作物，包括動物進行遺傳學改造。近幾年來，科研人員們已經使用CRISPR技術對袖珍豬（petite pigs）進行了遺傳學改造，也開發出了抗病的小麥和水稻。他們也正在開發無角的牛、抗病的山羊和富含維生素的甜橙等新品種。Doudna估計她的CRISPR技術適用物種清單還會進一步擴充。她表示，現在大家對商業價值沒那麼大，但是從研究的角度來說很有意思的植物（或家庭果園植物）里的信號通路進行CRISPR實驗或改造的興趣越來越大。

CRISPR技術能夠對DNA進行精準編輯的能力有利於我們對DNA進行精確的改造，但是這也同時讓監管者和農民們難以區分哪些是之前就已經存在的人工改造品種。在美國北卡羅來納州立大學（North Carolina State University in Raleigh）從事科學政策研究的Jennifer Kuzma就表示，由於有了基因編輯技術，我們就無法做到對人工改造產品進行真正意義上的追蹤，我們將很難辨別哪些物種是經過人工改造的，哪些物種是天然突變的。

我們很難辨別哪些物種是經過人工改造的，哪些物種是天然突變的。

這也就給我們敲響了警鐘，也給試圖出台基因編輯動植物管理條例的國家出了一道難題。比如FDA就已經批准人工遺傳學改造的動物可供人類食（使）用，但他們還沒有就基因編輯動物的使用發表相關意見。

根據現有的管理規定，並非所有接受過基因組編輯的農作物都需要接受美國農業部（US Department of Agriculture）的監管（Nature 500， 389–390； 2013）。不過今年5月，美國農業部開始向各方諮詢，該如何改進他們的人工遺傳學改造農作物管理辦法，美國農業部的這一舉動也釋放出一種信號，標明他們在面對CRISPR等新技術的當下，也在重新審視現有的監管方案。據Kuzma介紹，窗子已經打開了一條縫，不過還沒人知道裡面會透出點什麼。但是無論如何，窗戶被打開本身就已經讓人很興奮了。

除了農業之外，科研人員們也在考慮如何將CRISPR技術應用於野外的生物。大家的注意力主要都集中在gene drive這項新策略上。所謂gene drive就是能夠在一個種群內快速傳播人工編輯基因的方法。目前該技術雖然還處於起步階段，但是該技術卻有著很多的用途，比如可以快速清除攜帶致病原的蚊蟲或蜱、蟎，消滅侵入性植物，或讓美國農民們異常頭痛的藜的耐除草劑基因。

通常來說，一個遺傳變異往往需要很長的時間才能夠在一個種群內傳播開。這是因為在繁殖時，遺傳突變只能夠傳到子代兩條染色體中的一條染色體上。但是使用gene drive技術就可以讓每一個子代體內通過CRISPR技術在一條染色體上引入的突變自我複製，於是能夠讓幾乎所有的子代全都攜帶上這種人工改造過的突變，形成指數級增長。一個蚊子在一個夏季之內，就可以讓種群內所有的蚊子全都攜帶上同一種突變。如果這種突變是能夠減少蚊蟲子代數量的突變，那麼該種群都會滅絕，它們體內攜帶的瘧原蟲當然也就被一併清除掉了。

不過還是有很多科研人員對於這種影響整個種群的做法表示了憂慮，因為這樣做不知道會給整個生態系統帶來什麼樣的改變和結果，比如可能會出現其它害蟲，或者會影響食物鏈上層的物種等。大家還擔心，隨著時間的流逝，嚮導RNA在將來可能還會對另外一段DNA序列發揮作用，並且在種群內傳播開，帶來不可預知的影響和結果。

美國哈佛大學醫學院（Harvard Medical School in Boston）的生物工程師George Church認為，必須得有相當高的性價比，否則就不應該採用這種手段，因為這是不可逆的操作，風險太大，而且很難預測會對其它的物種帶來什麼樣的影響。」2014年的4月，Church和一幫科學家及政策專家聯合在《科學》（Science）雜誌上發表了一篇評論文章，他們提醒科研人員們應該注意種群改造的風險，而且提供了一些參考意見，指導大家應該如何防範gene drives實驗意外泄露的問題。

那時看來，gene drives似乎離我們還很遙遠。但是一年的時間都不到，美國加州大學聖地亞哥分校（University of California， San Diego）的發育生物學家Ethan Bier和他的學生Valentino Gantz就發表了文章，報道了他們在果蠅種群中的gene drives研究工作。Bier和Gantz使用了一種里外共有3層的盒子來飼養實驗果蠅，而且他們實驗室的安全級別達到了用來研究感染有瘧原蟲的蚊子的安全級別。但是他們並沒有完全遵照Church等人的安全指南，比如就沒有設計一種能夠逆轉整個遺傳學改變的方案。Bier表示，他們只是在進行原理驗證試驗（proof-of-principle experiments），看看這種技術是否有效，還沒有開展更加複雜的後續研究工作。

對於Church和其他人而言，這就是一個非常明確的警告，表明民主化使用CRISPR技術進行基因組編輯會帶來意想不到的、非意願的結果。Church等人那份評論的主要作者，美國麻省理工學院的政治學家Kenneth Oye表示，國家管理當局和國際社會有必要站出來，真的非常有必要。我們需要採取更多的行動。美國國家研究委員會（US National Research Council）已經成立了一個小組，專門討論gene drives問題，其他高級別的討論也都在進行之中。不過Oye擔心科技正在飛速發展之中，也許只有在發生了備受關注的gene-drive泄露事件之後才會做出管理政策上的改變。

這種問題不是非黑即白的問題。美國德州農工大學（Texas A&M University in College Station）的昆蟲生態學家Micky Eubanks表示，他第一次接觸到gene-drive這個概念時就被嚇了一跳。據Eubanks介紹，當他第一次聽到這個概念時的第一反應就是『我的天吶，這太可怕了，太瘋狂了』。但是當你再想想，尤其是與我們已經，並且在繼續對自然環境造成的改變對比一下，你就會發現，gene-drive也不過就是大海里的一個小水珠。

很多科研人員都會把CRISPR技術與其它那些曾經給我們帶來過希望和失望的新技術相提並論。美國賓夕法尼亞大學（University of Pennsylvania in Philadelphia）的醫學遺傳學家James Wilson在上世紀90年代時就身處基因治療大熱潮的核心，直到臨床試驗失敗，一名年輕人喪生之後，這股熱潮才慢慢冷卻下來，直到最近才又有所回暖。Wilson表示，CRISPR技術還非常年輕，我們可能還需要好多年的時間才能夠真正認識該技術的潛力。「CRISPR技術正處在爆炸式增長的階段，相關的一切還都在發酵、醞釀之中。」Wilson這樣說道。

Wilson自己也被CRISPR技術給閃了一下。據他介紹，他在一開始也對該技術持懷疑態度，直到他們實驗室開始使用這項技術。他表示，CRISPR技術最終一定會在臨床治療領域發揮重要的作用，這種技術真的非常偉大。