分子生物學專題——載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜

06-18

載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜

一、載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜
目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒DNA是一種新的非病毒轉基因載體。
一個合格質粒的組成要素：

（1）複製起始位點Ori即控制複製起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個複製起始點。而真核生物DNA分子有多個複製起始位點。
（2）抗生素抗性基因可以便於加以檢測，如Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段
（4）P/E啟動子/增強子
（5）Terms終止信號
（6）加poly（A）信號可以起到穩定mRNA作用
選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如<>選質粒。
（2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
（3）對原核表達載體應該注意：選擇合適的啟動子及相應的受體菌，用於表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易於鏈接，不能產生閱讀框架錯位。
綜上所述，選用質粒（最常用）做載體的5點要求：
（1）選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌裡面（2）一般使用鬆弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<>個。
（3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的餘地；
（4）必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。
（5）滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒游標記，是否需要加入標籤蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然後採用適當的限制酶將載體DNA進行切割，獲得線性載體分子，以便於與目的基因片段進行連接。

如何閱讀質粒圖譜？
第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什麼篩選標記。
（1）Ampr水解β－內醯胺環，解除氨苄的毒性。
（2）tetr可以阻止四環素進入細胞。
（3）camr生成氯黴素羥乙醯基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶使G418（長那黴素衍生物）（5）hygr使潮黴素β失活。
第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便於外源基因的插入。如果在這些酶切位點以外有外源基因的插入，會導致某種標誌基因的失活，而便於篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小於10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

（1）啟動子－促進DNA轉錄的DNA序列，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合併使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
（2）增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子－負增強子，（3）核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對於原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。
（4）轉錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最後一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。結構基因的最後一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T豐富區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。
質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.根據表達宿主不同，構建時所選擇的載體也會不同。

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