分析腫瘤微環境中的免疫逃逸機制 －抗原呈遞

在腫瘤免疫治療系列的上一篇結尾，我介紹了Robert Schreiber等人從腫瘤微環境視角提出的「免疫編輯」（immunoediting）假說。該假說將免疫系統與腫瘤細胞之間的相互動態作用分為三個階段：免疫清除（elimination）、免疫平衡（equilibrium）和免疫逃逸（escape）。當發展至免疫逃逸時，腫瘤組織已生長到臨床影像學可見的程度，並通過「免疫雕刻」（immunologically sculpted）過程建立起具有免疫抑制性的微環境。分析腫瘤的免疫逃逸機制可以幫助臨床醫生制定更靈活有效的聯合治療策略。然而，腫瘤微環境異常複雜，需要整合多種分析技術才能掌握全面的信息。今天，我就以本系列開篇講解的腫瘤免疫周期（thecancer-immunity cycle）為線索，與讀者共同探討腫瘤微環境中的各種已知的逃逸機制以及相應的分析策略，希望能為您的臨床研究帶來一些啟發。本期文章是腫瘤免疫治療系列刊載的第三篇，本系列的主題依次是：一、腫瘤免疫周期和相關臨床藥物機制二、腫瘤免疫學的理論發展和分析策略三、CAR-T細胞治療和免疫檢查點藥物BMS在本月初向CFDA藥品審評中心提交Opdivo的上市申請並獲得承辦受理，相信以免疫檢查點藥物和CAR-T治療為代表的免疫治療會在2018年加速滲透腫瘤臨床市場。本系列的第四篇將於12月年繼續在基因智慧首發，敬請期待！腫瘤微環境可被比作一個以細胞為單元的微觀生態系統。這種生態雖小，但並不比宏觀生態系統（如熱帶雨林和非洲草原）更容易研究，因為每一例腫瘤活檢樣本中的細胞類型、比例、位置、狀態和相互作用都具有獨特性。理解腫瘤細胞在微環境里如何與其他細胞互動並形成免疫逃逸狀態，是未來腫瘤研究和藥物開發的一個重要方向。為了簡化討論，我將從腫瘤免疫周期（詳見本系列第一篇）出發，著重分析腫瘤微環境中可能發生免疫逃逸的3個環節：一、樹突狀細胞提呈腫瘤抗原後進入淋巴結；二、激活的T細胞穿過血管壁浸潤到腫瘤微環境；三、識別到腫瘤細胞後，T細胞增殖並溶解腫瘤細胞。當以上任一環節受到腫瘤微環境的抑制，宿主免疫系統對腫瘤細胞的清除都會受到嚴重影響（圖1）。根據「免疫雕刻」的概念，這種免疫抑制性微環境並非腫瘤細胞能夠獨自建立的，而是從腫瘤細胞與周遭環境的相互拮抗和鬥爭中逐步演化而來的。所以，臨床獲得的腫瘤活檢組織中，腫瘤細胞和腫瘤微環境既相互依存，又相互促進。今天的文章將先討論第一個環節，關於後兩個環節的討論將在刊載在本系列的後續文章中。

圖1. 腫瘤微環境中存在各種機制來阻隔T細胞浸潤和抑制其殺傷作用一、樹突狀細胞提呈腫瘤抗原後進入淋巴結人體的大部分體細胞會表達MHC I（主要組織相容性複合體）抗原呈遞分子，它具有協調特異性免疫和非特異性免疫的重要作用。在正常情況下，MHC I呈遞分子會忠實地在細胞表面展示細胞內部存在的很多蛋白質片段，T細胞會識別出其中的「異己」片段，並清除掉展示了「異己「片段的細胞，這也是特異性免疫和腫瘤免疫治療的基礎。然而，腫瘤細胞也是由正常細胞演變來的，其主要的抗原成分與正常細胞差別很小。如果不能精確選擇「異己」標籤，並平衡T細胞對腫瘤細胞的殺傷和對正常組織的耐受，就可能會引起嚴重的自免疫反應。所以，找到特異性高的腫瘤抗原並激活能夠識別它的T細胞就成了腫瘤免疫學的一個重要的問題。具體分析時，有三個研究方向：1）腫瘤細胞具有多少（或哪些）可被宿主免疫系統識別的抗原；2）腫瘤細胞自身的呈遞系統是否能夠將這些抗原加工提呈；3）樹突狀細胞能否識別腫瘤抗原後分化成熟並進入淋巴結。1. 解析腫瘤抗原可被分子識別的腫瘤抗原根據來源分為6種：1）腫瘤病毒編碼的蛋白（如HPV的E6和E7）；2）攜帶突變的驅動基因或抑癌基因（如EGFR和TP53）；3）組織特異性的分化抗原（如CD-19和Tyrosinase）；4）腫瘤睾丸抗原（cancertestis antigens，如NY-ESO-1）；5）異常高表達的基因（如HER-2）；6）轉錄或表達後被異常修飾的蛋白（如NA17和MUC-1）。對於已知的腫瘤抗原（如E6、HER-2和MUC-1等），通常在腫瘤組織切片上直接進行免疫組化（IHC）檢測。IHC檢測在腫瘤病理診斷和臨床前藥物研發中已經非常普遍。利用IHC分析已知腫瘤抗原的制約因素有：1）抗體探針的設計難，時間長；2）檢測和分析通量較低；3）分析標準化和定量化難。針對後兩點，可以分別通過組織晶元和數字病理軟體一定程度解決，但抗體探針的設計難仍然是根本瓶頸。對於暫時缺少可靠抗體探針的目標腫瘤抗原，可以考慮使用RNA原位雜交技術進行檢測。目前，美國的細胞治療臨床前研究中已經普遍採用如RNAscope這樣的新型RNA原位雜交技術，尋找免疫生物標記物在微環境中的表達情況（下期將具體介紹）。然而，上述的已知抗原多為異位表達或過量表達的正常人體蛋白質，免疫系統很難將其標記為「異己」（否則會有自免疫反應）。能夠特異性激活免疫系統的一般是突變造成的腫瘤新抗原。現有的新抗原分析流程較為程序化但流程複雜。這種分析技術源於傳統免疫學，目的是根據歷史數據進行抗原表位（epitopes）分析，輔助疫苗設計和過敏原診斷。因為編碼MHC抗原呈遞分子的HLA基因簇（humanleukocyte antigen cluster）在人群中具有極高的多態性（圖2），同一段抗原表位雖然能被個體A的細胞呈遞到表面，但可能在個體B的體內就無法與呈遞分子有效結合（本系列上篇中講到的移植排異反應就是人群中MHC的多樣性引起的）。已開發的腫瘤抗原應用主要服務個體化免疫治療，包括為腫瘤個性化疫苗（見本系列第一篇）和過繼細胞治療提供合理藥物設計的依據（圖3）。

圖2. 人體中HLA基因簇位於6號染色體，編碼MHC I型和II型抗原呈遞分子的基因被編碼其他免疫功能蛋白的所謂「MHC III型基因」分隔開，圖中深灰色標註的為假基因（pseudogenes），標註為淺灰色的是與免疫相關的其他基因，圖片來自《Janeway』s Immunobiology》

圖3. 使用全外顯子組測序來分析腫瘤抗原可以提高過繼細胞治療（ACT）的有效率分析腫瘤新抗原的策略是找到可能與患者的MHC 分子（主要是I型）結合的抗原表位後，合成出預測的抗原表位氨基酸序列，並通過體外T細胞激活實驗驗證新抗原的免疫原性（圖4）。具體來講，首先需要對患者的腫瘤樣本和正常對照組織做全外顯子組測序，利用生物信息演算法對該患者的HLA基因進行分型並探測出存在突變的基因。隨後，抗原表位預測軟體（如NetMHCpan）將根據這些信息，通過對比電荷分布、表位結合力和可及性等特徵來對潛在的腫瘤新抗原進行排序。接下來，利用新鮮腫瘤組織樣本中獲得的轉錄組信息，過濾掉排序較高但表達較低的腫瘤抗原（即不太可能有足夠的量被T細胞識別到），得到初步的腫瘤新抗原預測列表。最後，合成部分置信度高的腫瘤新抗原，將其添加到從患者外周血分離出的樹突狀細胞、T細胞（或從外周血單核細胞誘導獲得的T細胞）等免疫細胞中，通過酶聯免疫斑點法（ELISPOT）檢測來驗證預測出的新抗原能否激活宿主自身的免疫細胞。如果在細胞培養液中探測出T細胞分泌的干擾素γ （Interferon-γ），細胞培養皿中會觀測到免疫斑點（圖5），即表明合成的腫瘤抗原能夠誘導樹突狀細胞成熟並激活腫瘤特異性的T細胞。

圖4. 腫瘤新抗原的標準預測流程

圖5. ELISPOT是ELISA檢測的一種變體，靈敏度遠超細胞染色或ELISA，其陽性結果顯示的是免疫細胞群體中激活後分泌免疫球蛋白或細胞因子的細胞的比例（如右圖）需要強調的是，上述腫瘤新抗原分析中非常關鍵的一步是表位預測計算。該計算需大量調取免疫表位資料庫IEDB（Immune Epitope Database）中表位結合力信息。IEDB資料庫是美國NIH花費重金創造的世界最大的表位資料庫，旨在服務於全世界的生物醫學研究。從2003年起，IEDB不斷收錄來自病原微生物、過敏源及其他能夠激發免疫系統的表位物質數據。新的數據生成策略勢必會優化IEDB的數據質量，從而提升後期腫瘤新抗原驗證效率。關於免疫表位的最新研究，推薦有興趣的讀者閱讀CatherineWu在今年發表在Nature的文章《MassSpectrometry Profiling of HLA-Associated Peptidomes in Mono-allelic CellsEnables More Accurate Epitope Prediction》。相較於複雜的個體化腫瘤抗原分析和驗證，當下臨床治療熟悉的兩個免疫治療生物標記物，微衛星不穩定性（MSI/MMR）和腫瘤突變負載（TMB），在之前的幾項研究中被認為是通過產生腫瘤新抗原而與CTLA-4和PD-1免疫檢查點抑製劑的療效存在聯繫。不過這之間的關聯性並不像想像的那樣顯而易見。在一項利用小鼠結腸癌MC-38細胞模型開展的腫瘤抗原分析中，科學家發現只有約10%的非同義點突變產生的肽段可以與MHC I型分子有效結合，而這少部分抗原肽中的一小部分才能通過疫苗方式產生免疫原性（表明實驗驗證腫瘤抗原的必要性）。這可能是因為部分與MHC分子結合的表位序列上，由突變產生的氨基酸側鏈並未指向T細胞受體（TCR）接觸的方向，所以TCR無法區分該突變產生的抗原肽與正常肽段（圖6）。此外，不同免疫表位引起的免疫原性反應也並不相同，說明單純通過腫瘤抗原數目衡量腫瘤整體的免疫原性反應的做法，雖然比MSI和TMB更加可解釋，但依然有可改進的空間。為了更準確地預測免疫系統可識別的腫瘤抗原，需要免疫學家進一步研究免疫原性的決定因素。

圖6. 由於TCR與MHC I結合時只能接觸到抗原表位的一側，不是所有可以結合MHC I分子的腫瘤抗原表位都會產生免疫原性，右圖是 MHC I-抗原肽-TCR三元體的空間結構圖，TCR在上，MHC I分子在下，中間黃色的橫條是抗原肽2. 分析抗原呈遞如果腫瘤細胞持續表達並呈遞上述具有免疫原性的抗原肽，可能會提高自身被免疫系統探測到並清除的風險。在正常的體細胞內，MHC I型分子負責結合潛在抗原（被水解的DRiPs），並將其呈遞到細胞膜表面，等待被 T細胞檢查（詳見本系列第一篇）。目前，可以通過對腫瘤組織切片進行針對MHC I型分子的IHC檢測（或對編碼MHC I型分子的HLA-A/B/C進行mRNA定量檢測）來分析抗原呈遞功能的缺陷。一般的免疫反應中，細胞因子會刺激體細胞增強抗原呈遞相關分子的表達量，提高抗原肽的暴露。然而在不同癌種中，科學家已發現有30-80%的腫瘤細胞表面出現了MHC I型分子的表達下降或缺失，而且下降的程度與腫瘤的惡化程度呈正相關。從人類蛋白圖譜（Human Protein Atlas，HPA）資料庫中，可以查詢到各個癌種中不同HLA的表達數據及相應的患者生存期信息（圖7、8）。

圖7. HLA-B蛋白表達量陽性（左圖）和陰性（右圖）的檢測結果，來自HPA資料庫編號為1910和2083的兩位女性乳腺癌患者的樣本

圖8. HPA資料庫中對卵巢癌患者的HLA-A mRNA量與生存期之間關係繪製的Kaplan-Meier圖腫瘤細胞中出現的MHC I抗原呈遞障礙可分為可逆和不可逆兩類。由腫瘤病毒和原癌基因引起的轉錄水平或表觀遺傳水平上的抗原呈遞異常通常是可逆的，而由HLA-A/B/C和β2 microglobulin（圖9）等基因的結構缺陷或缺失導致的抗原呈遞異常往往是不可逆的。除了MHC I抗原呈遞分子本身外，負責加工和提成抗原的蛋白質的功能異常也會阻礙MHC-抗原肽-TCR三元體的形成，影響腫瘤免疫應答的信號產生。

圖9. 當呈遞抗原肽的MHC分子與TCR結合時，T細胞的CD8或CD4分子也會與對應的MHC結合，穩定MHC-抗原肽（中間深紅色）-TCR三元體，其中作為MHC I分子組成部分的β2 microglobulin是左下圖中淺紅色的分子，圖片來自生物藝術家David Goodsell腫瘤細胞在降低自身抗原呈遞的同時，還可能通過表達非經典的HLA-I型分子來更進一步實現免疫逃逸。在上面圖2中顯示的人類HLA基因簇中存在一個 HLA-G基因，它編碼的蛋白是存在於母胎界面的一種免疫耐受分子，能夠在胎兒發育階段抑制母體的T細胞和NK細胞的細胞殺傷性，同時抑制樹突狀細胞的成熟和抗原呈遞。HLA-G很少在健康組織中被檢測到，但已有報道發現其在包括黑色素瘤、腦膠質瘤、乳腺癌、卵巢癌等癌種中出現高表達情況，這可能與腫瘤維持長期的免疫逃逸有關。有意思的是，多項結直腸癌的病理研究顯示，HLA-A/B/C型分子高表達的腫瘤患者（呈遞系統正常）預後好於低表達的患者，但HLA-A/B/C和HLA-G同時表達缺失的患者反而預後好於高表達的患者。這種現象在本系列第一篇中有涉及到，MHC I型複合體缺失的腫瘤組織在小鼠實驗模型中也可以被部分清除。這種現象被懷疑是NK細胞殺傷的結果。已知在腫瘤組織中高表達的HLA-G可與NK細胞表面的殺傷細胞抑制受體（Killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR）結合，通過激活KIR的免疫受體酪氨酸抑制序列來抑制NK細胞殺傷性。所以，在人體免疫細胞識別「異己」的過程中，NK細胞填補通過T細胞留下的一個系統漏洞，即腫瘤通過MHC I表達缺失一次性完成免疫逃逸。其實不僅僅是NK細胞，巨噬細胞也存在這樣的「補漏」功能。前天，在Nature上發表的最新研究報道，MHC I型分子中的β2 microglobulin模塊可以通過與巨噬細胞表面的抑制性受體蛋白LILRB1結合（圖10），向巨噬細胞傳遞「不要吃我」的安全信號（該研究中採用的流式細胞儀分析策略會在下兩篇中討論）。MHC I–LILRB1的信號傳遞此前在NK細胞中也有研究。這些研究從另一個角度解釋了MHC I呈遞分子表達完全缺失的患者為什麼預後反而更好，因為非特異性免疫系統能夠對「抵抗巡查」的細胞直接「開炮」。相信未來，科研人員會發現更多腫瘤細胞在抗原呈遞上的缺陷，為臨床治療和藥物研髮帶來全新的策略。

圖10. LILRB1–β2M–HLA-A2蛋白複合體的晶體結構，藍色模塊MHC I分子中的β2microglobulin（β2M）模塊通過與巨噬細胞的LILRB1抑制性受體結合，提供防止被巨噬細胞攻擊的信號（請注意它在圖9中為淺紅色），圖片來自原文《Engagementof MHC class I by the inhibitory receptor LILRB1 suppresses macrophages and isa target of cancer immunotherapy》如果讀者對利用HLA-I型分子表達來進行預後分析感興趣，推薦閱讀2014年的文章《Combined analysis of HLA class I, HLA-E and HLA-G predicts prognosis in colon cancerpatients》。對HLA-G的表達和多態性問題想了解更多的讀者，推薦閱讀2015年的文章《Balancing immunity and tolerance: genetic footprint of natural selection in thetranscriptional regulatory region of HLA-G》。3. 分析樹突狀細胞樹突狀細胞是諾貝爾獎得主Ralph Steinman於1973年發現的一種特化的抗原呈遞細胞（詳見本系列上一篇），負責攝取、加工和提成抗原後轉移至淋巴結去激活淋巴細胞。在正常的腫瘤免疫周期中，被治療手段殺死的腫瘤細胞會釋放抗原到腫瘤微環境中，未成熟的樹突狀細胞不斷從中提取可能的抗原肽。當形成MHC-抗原肽複合體後，在微環境中多種免疫原性信號的共同刺激下，樹突狀細胞會被激活並通過淋巴系統轉移至區域淋巴結。在淋巴結中，樹突狀細胞與能夠識別其所呈遞的腫瘤抗原的T細胞結合，並表達共刺激分子B7協同誘導T細胞增殖和分化（詳見本系列第一篇）。然而，腫瘤微環境中觀察到的樹突狀細胞經常有抗原提呈或分化上的功能障礙。據報道，在腫瘤微環境中浸潤中，有80%以上的樹突狀細胞缺乏激活T細胞所必需的共刺激分子B7，影響腫瘤特異性免疫的啟動。免疫微環境中有多重因素造成樹突狀細胞類似這樣的功能異常。首先是混亂的信號因子影響。大多數腫瘤細胞和部分腫瘤間質細胞向微環境中釋放血管內皮生長因子（VEGF），而VEGF會抑制樹突狀細胞的成熟和分化，阻礙了其向初始T細胞呈遞抗原的功能，最終影響到T細胞的活化和擴增。除VEGF外，腫瘤微環境中的IL-10和GM-CSF也會干擾樹突狀細胞的抗原呈遞功能。這些信號因子都可以通過單抗或RNA分子探針進行分析鑒定，確認腫瘤樣本與正常組織間是否存在顯著差別。其次是受到代謝和生物化學的調控。例如，樹突狀細胞在缺氧的腫瘤微環境中會表達PD-L1並出現功能紊亂。除糖酵解外，樹突狀細胞的脂肪酸代謝調節也是一個重要的研究方向。隨著對腫瘤微環境中樹突狀細胞功能異常的理解深入，出現了一些通過改善局部樹突狀細胞活性來提升微環境中的抗原提呈效率的治療新思路。推薦讀者閱讀2016年在Nature上發表的一篇文章《Biomaterialsand emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment》。與之前Provenge的體外激活不同，本文介紹了一種在腫瘤微環境中激活樹突狀細胞來強化抗原呈遞效果的疫苗新療法（圖11）。

圖11. 新型的疫苗思路：讓可植入生物材料精確釋放GM-CSF來募集宿主的樹突狀細胞，這些樹突狀細胞會被生物材料上的腫瘤抗原和死亡細胞釋放的CpG信號激活
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