微生物檢驗技術考試要點(整理

檢驗技術資格考試考點精要——微生物學檢驗(中級)

1. 生物學按界門綱目科屬種分類，種是最小單位。病毒分類:目、科、亞科、屬、種。屬名--VRirus結尾的單詞,亞科名--VRirinae結尾的單詞,科名--VRiridae結尾的單詞。目名—VRirales。2004年ICTV公布病毒分為:73個科、11個亞種、289個屬。

2. 結核菌可利用甘油為碳源，梭狀芽胞菌可以氨基酸為碳源，流感嗜血桿菌要?，?因子才能生長。

3. 藥物敏感試驗:紙碟法、小杯法、凹孔法、試管法。常用單片紙碟法、試管稀釋法(以抗菌藥物的最高稀釋度仍能抑制細菌生長或殺菌管為終點，該管含葯濃度為最低抑菌濃度MIC或最低殺菌濃度MBC)，兩值越低則表示越敏感。MIC與抑菌圈呈負相關，即抑菌環直徑越大，MIC越小。

各葯敏紙片間距不少於24mm，距平板內緣不小於15mm。

藥物敏感實驗判定標準 :抑菌圈直徑(毫米):20以上極敏、15~20高敏、10~14中敏、10以下低敏。不同的菌株、不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標準或者CLSI標準。

多黏菌素抑菌圈;在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。

4.常用的免疫技術:酶免疫技術(EIA)、協同凝集試驗、免疫熒光技術(IF)、對流免疫電泳(CIE)、免疫印跡技術。

5.病原菌核酸的檢測:核酸雜交、PCR技術、基因晶元技術。

PCR技術—是選擇DNA或RNA體外擴增技術，用標本提取DNA為擴增模板，選用一對特異寡核苷酸為引物，PCR一般要經歷三十多次循環，經不同溫度變性93-94?(作用1min氫鍵斷裂形成單鏈DNA)、退火40-60?(迅速冷卻30-60s引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈)、延伸70-75?(在TaqDNA聚合酶作用下，以A、T、G、C四種脫氧核苷酸為原料，從引物5』?3』端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。)，擴增產物用溴乙啶染色的凝膠電泳。其具有特異、快速、靈敏、特異性強、操作簡便、能夠定量。引物是PCR特異性的決定因素，PCR反應中TaqDNA聚合酶、引物加量過多，可引起非靶序列擴增。

變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變: 1)溶液粘度降低。2)溶液旋光性發生改變。3)增色效應。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為" 退火"，Tm低25?左右的溫度是復性的最佳條件。核酸實驗中經常以迅速冷卻至4?以下方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。

基因晶元技術(DNA晶元、DNA微陣列)—主要過程:DNA微陣列的製備、樣品的製備、靶分子和探針之間的雜交、雜交信號的檢測與分析。具有快速、敏感、高通量檢測平台。

核酸雜交(基因探針雜交技術)--是指單鏈RNA和DNA或DNA和DNA或RNA和RNA，根據鹼基配對原則，借氫鍵相連而形成雜交分子的過程。雜交百分率,70%(?69%)為高度同源性，同源性在60%以上是一個種，同源性在60%--70%是同一種內不同亞種，同源性在20%--60%同一屬內不同菌種，同源性

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20%?不同屬的菌種。

AFLP的含義是----擴增片段長度多態性。有很大功能的DNA指紋技術。一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。

6.細菌診斷流程有:雙岐索引法，表解法，數字編碼鑒定法。致病性島:由基因編碼決定的一團與致病性相關的基因組。

7. 病原細菌確定原則:(郭霍Koch原則)1、從一種疾病病人中能有規律地發現一種細菌2、能夠分離這種細菌獲得純培養3、把這種細菌的培養物引入易感動物體內，可以引起與病人類似的疾病4、在實驗感染引起的疾病中仍然能夠分離同一種細菌。

8. 桿菌肽用於A(敏感)與非A群鏈球菌的鑒定。O/129抑菌試驗對弧菌有用而對氣單胞菌無用。

9. 奧普托欣試驗:肺炎鏈球菌敏感。

10. 雜交分:斑點，菌落原位，Southern(DNA)印跡，Northern(RNA，DNA)印跡。

11. L型細菌:細胞壁缺陷(形態多樣，染色不定，可過濾，滲透壓敏感，生化減弱等)培養應高滲透壓(3-5%氯化鈉、20%蔗糖)，瓊脂濃度0.5以下半固體培養基。染色多為G染陰性，形態不一(巨球形是特徵)，固定要用10g/L鞣酸不能用火焰。

增殖:以二分裂、出芽、巨形體釋放顆粒方式。一般菌落有:油煎蛋樣(L)，顆粒型(G)，絲狀菌落(F)，鑒定要點:染色易變多形性，生長在增菌液中微渾，顆粒樣沉澱或沿試管壁生長，返祖現象。致病特點:慢性和反覆發作性感染，致病物質是毒素。L型細菌在體內體外都可形成。原生質體與原生質球都是細胞壁缺陷的細菌。

12. 細菌的突變:基因突變(又稱點突變;有鹼基對的置換、插入、或缺失、錯碼)、染色體畸變 (易位、倒位、重複、缺失)。突變:自發突變、誘發突變。質粒在細菌的自發突變中起重要作用。細菌質粒在重組DNA技術中常用的載體。質粒的分離提純使用酚處理，用乙醇沉澱。

13.噬菌體--是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，專性胞內寄生，有嚴格的宿主特異性。由核酸和蛋白質組成。大多數DNA噬菌體的DNA為線狀雙鏈(有尾噬菌體的核酸);RNA噬菌體的RNA為線狀單鏈(無尾噬菌體的核酸為環狀單鏈DNA或線狀單鏈RNA)。對紫外線敏感10-15分鐘失去活性。噬菌體分毒性噬菌體、溫和噬菌體(溶原性噬菌體);毒性噬菌體以複製方式增殖，過程吸附、穿入、生物合成、成熟與釋放，少脫殼。在液體培養基中使混濁菌液變澄清，在固體培養基上形成噬斑。溫和噬菌體---是噬菌體基因組整合於宿主菌染色體中，有溶原性周期、溶菌性周期。噬菌體可以根據不同細菌的表面受體來裂解目標菌---是判定某些種類病原體的重要依據。

14. 肽聚糖的結構由聚糖骨架，四肽側鏈和五肽交聯橋(G,無交聯橋)。磷壁酸為G，特有，分壁和膜兩種。外膜層由脂多糖，脂質雙層，脂蛋白組成。細胞質內有核蛋白體(蛋白合成地)，核質(主

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要遺傳物質)質粒，胞質顆粒，是細菌蛋白質和酶類合成的重要場所。鞭毛是由細胞質伸出的蛋白性絲狀物。性菌毛僅有1,10根，毒力和耐葯質粒都能通過它轉移，有致病性。

15. 免疫器官:骨髓、胸腺、脾、淋巴結、扁桃體、小腸集合淋巴結、闌尾和黏膜免疫系統。免疫細胞:淋巴細胞、單核吞噬細胞、中性粒細胞、嗜酸嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、血小板。免疫分子:補體、免疫球蛋白、細胞因子

中樞免疫器官:骨髓、胸腺、鳥類法氏囊。外周免疫器官:淋巴結、脾和粘膜相關淋巴組織 特異性免疫:體液免疫、細胞免疫。

+體液免疫:(B淋巴細胞介導，CD4Th輔助，Th2細胞能分泌細胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10);效應是抗體(Ab);1、病毒中和抗體(不能直接滅活病毒，IgG、IgM、IgA)2、血凝抑制抗體(HLAb)3、補體結合抗體。

IgG在體液中含量最多，分子量小是唯一能通過胎盤的抗體。IgM分子量大，是最早產生的抗體，中作早期診斷。IgA存在黏膜分泌液中，在局部可阻止病毒侵入，能抵抗蛋白酶的水解作用，具局部抗體。IgE可與肥大細胞膜上的Fc受體結合。

補體C:存在血清中，不耐熱，可輔助特異性抗體介導的溶菌作用，是抗體發揮溶細胞作用的必要補充條件。由9種成份，11種蛋白組成。補體激活兩個途徑:傳統途徑(一)---被Ag-Ab免疫複合物IC活化，順序C1、C4、2C、3C、5C、6C、7C、8C、C9。旁路途徑(二)---被細胞的脂多糖激活。補體激活---酶促級連反應。

++細胞免疫(T淋巴細胞介導，效應細胞:細胞毒性T細胞(CTL)、CD4Th1細胞、CD8毒性T細胞CTL)。Th1細胞誘導產生遲髮型超敏反應(DTH)

16.測特異性抗原最常用實驗:凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光試驗、膠體金免疫吸附試驗

17. 細菌營養轉運的方式有:離子，透性酶，磷酸酶。營養物質進入機體的方式:易化擴散、主動運轉(由透性酶完成)、基團移位(糖類由磷酸酶磷酸化進入胞內，不能再透出菌體)。

18. 細菌生長繁殖的條件:充足的營養、適宜的溫度、合適的酸鹼度、必須的氣體環境。細菌生長的溫度極限-7--90?: 嗜冷菌最適溫為10,20?，嗜溫菌為20,40?，嗜熱菌為50,60?。適宜的酸鹼度PH7.2—7.6。細菌生長繁殖分為四期:遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期

19.(腸道桿菌)細菌的四種生化反應:吲哚(I)、甲基紅(M)、VP(V)、枸櫞酸鹽利用(C)，合稱為IMViC。大腸桿菌呈++--，產氣桿菌呈--++。還需做糖發酵試驗，KIA產酸產氣，MIU，――，有菌體(O)莢膜(K)鞭毛(H)三抗原。腸桿菌科分型多採用苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗。可疑菌分別接種克氏雙糖鐵(KIA)尿素靛基質動力(MIU)來定屬。

細菌代謝所需能量主要以生物氧化作用而來。細菌新陳代謝的產物:熱原質、毒素與酶、色素、抗

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生素、細菌素。熱原質除去的最好方法---蒸餾。內毒素(G-脂質A)、外毒素(G+產生的毒性蛋白質產物，具有抗原性強、毒性強、作用特異性強、不耐熱、人工化學可脫毒性，0.4%甲醛脫毒後形成類毒素進行人工免疫)。據親和性及作用靶點分為:神經毒素、細胞毒素、腸毒素。細菌的內毒素一般由:脂質A(主要成份)，非特異性核心多糖，菌體特異性多糖。一般7,10天後機體產生特異性免疫。IgG和IgM能在血中直接中和病毒。

熱原質:脂多糖，多由G-產生，耐高溫，可引起發熱反應，高壓蒸氣滅菌(121?20分鐘)使其破壞。

20. 細胞壁的作用:承受胞內高滲壓、支持細胞膜、維持細菌形態;是鞭毛運動的支點。 細胞壁的主要成份:肽聚糖(又稱黏肽、胞壁質)，是原核生物特有的成份，能破壞肽聚分子結構或抑制其合成的物質，都有抑菌和殺菌作用。

G-菌細胞壁的主要成份:肽聚糖、脂蛋白、外膜、脂多糖(LPS)(類脂A、核心多糖、特異性多糖)，菌體脂多糖(LPS)能引起發熱故稱熱原質，又稱為細菌的內毒素。

細胞膜的主要功能:物質納泄、生物合成、呼吸作用、形成中介體。

細胞質中的異染顆粒主要成份:RNA、多偏磷酸鹽

又能防止金屬生鏽。 21.有芽胞破傷風菌需沸水煮3h才殺死。水中加入2%碳酸鈉能將沸點提到105?

22. 紫外線波長265,266nm時殺菌力最強。日光燈波長約0.5μm。

23. 濾菌器用於除菌的孔徑是0.22μm，另外以石棉板為濾板的金屬濾器稱Seitz濾器(蔡氏濾器)按濾孔大小分K:最大，澄清用，EK-S最小，可阻止大病毒通過EK:居中，除去一般細菌。玻璃濾菌器分G1,G6，G5，G6兩型能阻止細菌通過。

24. 高壓滅菌指示物:嗜熱脂肪芽胞桿菌(ATCC 7053)，紫外線殺菌指示物:枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC 9372)。

25. 細菌遺傳物質主要在於染色體、質粒和轉位因子中。質粒:不依賴染色體而複製，不相容性，轉移性，指令性，大多數質粒在自然狀態下是一種閉合環狀雙鏈DNA。主要有耐葯質粒，Col質粒(編碼腸毒素)Vi質粒(編碼細菌與致病性有關的蛋白)。轉位因子為存在於細菌染色體或質粒上的一特異的核苷酸序列可在DNA中移動，主要有三類:插入順序(最小的轉位因子)，轉座子，轉座噬菌體。 質粒載體具有特點:複製起點、抗菌素抗性基因、多種限制酶的單一切點、較高的拷貝數

26.病毒的特性:1、只含一種核酸2、基因組複製3、缺乏完整的酶系統4、RNA病毒的RNA經反轉錄合成互補DNA(CDNA)。甘油(10,)或10%二甲基亞碸的血清作懸浮細胞的液體在液氮中保存細胞，在乾冰溫度(-70?)和液態氮溫度(-196?)下長期保存其感染性;將凍存在小管或安瓿里的細胞以較慢的冷凍速率(1?,分鐘)冷凍，直至—150?，再將這些小管貯存在—150,,196?的液氮中，解凍做法是:將封口的小管迅速放入37?的水中，直至所有的冰融化，然後打開管口，將內容物移入培養

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基。PH5-9穩定;射線和紫外線、X線、r線能滅活病毒。病毒學上常用的細胞類型:原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞。

27. 超凈工作台應採用層流技術凈化空氣、選擇垂直氣流通風方式。潔凈度可達百級，只保護樣品。

28.菌體蛋白電離後帶負電荷;而鹼性染料電離時染料離子帶正電。

29.染色程序及方法:製片?固定?媒染?染色?脫色?復染?水洗?乾燥?鏡檢。

革蘭染色法:初染(草酸銨結晶紫)、媒染(碘液)、脫色(95%酒精)、復染(番紅)。

抗酸染色法:5%石炭酸復紅、5%鹽酸酒精脫色、美蘭復染。

芽胞染色:菌懸液?孔雀綠?水浴15-20分鐘?塗片?乾燥?固定?水洗脫色?番紅或稀釋石炭酸復紅復染?水洗?晾乾

莢膜染色:(負染色法、墨水法)。負染色法:製片(蒸餾水+菌)?乾燥(晾乾)?染色(復紅)?水洗?乾燥(晾乾)?塗墨素。背景灰色、菌體紅色、莢膜無色透明

鞭毛染色---鍍銀法;媒染A液—10%單寧酸10ml+5ml飽和硫酸鉀鋁水溶液+1ml苯胺飽和水溶液+5%

5%硝酸銀+濃氨水(比重0.88)成薄霧狀。 氯化鐵水溶液成墨色。銀染B液—

製片(蒸餾水+菌)?乾燥(晾乾)?染色(A液3—5分鐘)?水洗?乾燥(晾乾)?染色(B液稍加熱分30—60秒)?水洗?乾燥(晾乾)。菌體深褐色、鞭毛褐色。

30.病毒吸附蛋白(VAP);血凝素(HAs)。病毒的複製周期:吸附、穿入、脫殼、生物合成及組裝、成熟和釋放

31.病毒突變株分:條件致死性突變株，空斑和宿主依賴性。遺傳型變異機制有突變，基因轉移，重組。突變:突變率由複製的準確度，DNA發生損傷的機會，及對損傷DNA修復程度來決定。

32.非特異性免疫:干擾素(IFN)、NK細胞 。干擾素(IFN)--具有廣譜抗病毒作用，只能抑制病毒，即通過誘導細胞合成抗病毒蛋白(AVP)發揮效應。

33.小淋巴細胞分為:T細胞、B細胞、K細胞。T細胞來自骨髓，在胸腺成熟。在人體血液中T細胞占淋巴細胞總數的60—70%，;在胸導管則佔95%以上。B細胞第一個合成產物是u鏈。

34.鹼基的置換:嘌呤換嘌呤，嘧啶換嘧啶為轉換，嘌呤換嘧啶為顛換。影響基因表達的因素有:調控部位，調節蛋白，效應分子。

35.轉化:受體菌直接攝取供體菌提供的遊離DNA片段，整合重組(與染色體重組)使受體菌的性狀發生變異。一般有鏈，嗜血，芽胞菌有此功能。

36. G，菌等電點pI=2,3，G,菌等電點pI=4,5。RNA主要存在於細胞質中占細菌乾重的10%，DNA存在於染色體和質粒中。G+菌的感受態是由感受態因子(CF)的胞外信號誘導的。

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