抗D免疫球蛋白在胎兒/新生兒RhD血型不合溶血病中的應用進展

06-17

抗D免疫球蛋白在胎兒/新生兒RhD血型不合溶血病中的應用進展

黃冰雪?王來栓

復旦大學附屬兒科醫院新生兒科

Rh血型系統是人類除ABO血型系統以外最重要的血型系統。Rh抗原主要有D、C、c、E、e等5種，其中以D抗原的免疫原性最強，且最為重要。若胎兒和母體RhD血型不合，即母體血型為RhD陰性，而嬰兒為RhD陽性時，就有發生RhD血型不合所致新生兒和胎兒溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）的風險。研究發現，在臨床應用抗D免疫球蛋白之前，RhD陰性婦女再次妊娠RhD陽性且ABO血型相合的胎兒後，發生同種免疫的概率約為16%[1]。1968年，抗D免疫球蛋白開始用於預防HDFN，此後孕母同種免疫的發生率明顯下降，與之相關的胎兒和新生兒死亡率也從46/100 000下降至1.6/100 000[2]。但在尚未開展預防性應用抗D免疫球蛋白的一些發展中國家，若發生RhD血型不合所致的HDFN，仍有14%的死產發生率，而在存活的新生兒中，也可有50%發展為腦損傷，甚至死亡[3]。
一、HDFN的治療
HDFN的臨床表現因免疫反應的嚴重程度而不同。在胎兒期，因紅細胞破壞，可發生胎兒貧血、水腫等表現，甚至發生胎死宮內。存活新生兒仍可表現為貧血、黃疸、水腫，部分可因膽紅素水平過高而發展為膽紅素腦病，出現神經系統後遺症；部分嚴重溶血患兒可在新生兒期死亡。對於明確為RhD陰性的孕婦，孕期需規律隨訪抗體滴度[4]，在24孕周前應每月監測1次，此後每2周監測1次。若抗體滴度始終處於較低水平，則可妊娠至足月分娩。如抗體滴度達到1∶32及以上，則需要檢查胎兒是否有溶血表現。可通過B超隨訪胎兒是否有水腫，並可通過羊水評估膽紅素水平，或採用多普勒超聲檢測胎兒大腦中動脈收縮期血流峰值，以判斷胎兒貧血程度。其中，大腦中動脈收縮期血流峰值的臨床應用價值較高，這一指標在監測胎兒貧血方面的可信度已得到多項研究證實[5-6]。目前這一指標已逐漸取代其他方法，成為胎兒貧血的主要監測手段。當提示胎兒嚴重溶血時，為進一步明確診斷，可考慮行臍靜脈穿刺。若胎兒紅細胞壓積＜0.3，則需行宮內輸血以改善貧血。若經治療，胎兒仍有嚴重的貧血相關表現，則需考慮評估胎肺成熟度及孕周，必要時在促胎肺成熟治療後終止妊娠。
二、抗D免疫球蛋白預防HDFN

RhD陰性婦女孕有RhD陽性胎兒時，在一些可能使孕母致敏的事件（potential sensitizing event，PSE）發生後，胎兒紅細胞均可能進入母體血液循環，發生胎兒-母體輸血[7]。隨孕齡增長，胎兒-母體輸血的量和頻率均會增加[8]。來自胎兒紅細胞表面的D抗原可刺激母體，產生抗體而致敏。當D抗原再次進入已致敏的母體循環後，記憶B淋巴細胞便可在短時間內產生大量可通過胎盤的IgG抗體。這些抗體進入胎兒循環，識別胎兒紅細胞表面抗原並與之結合，引發胎兒體內的免疫反應，即可發生溶血。但母體巨噬細胞吞噬RhD血型不合的胎兒的紅細胞，需經過一段時間才能釋放出足夠的抗原，且初發免疫反應發展緩慢，所產生的抗體不能通過胎盤屏障的IgM，故RhD血型不合溶血病常發生於再次妊娠，其中胎兒-母體輸血是同種免疫反應的基礎。目前我國對RhD血型不合溶血病的孕婦主要是監測和對症治療，缺乏特異性的治療手段。從RhD血型不合的發病機制可以發現，孕婦抗D同種免疫應答（即致敏過程）一旦完成，再次暴露於D抗原，就有可能產生溶血反應，使抗體介導的免疫抑制預防作用失效。因此，預防RhD血型不合新生兒溶血病的重點應當在於阻斷母體建立抗D免疫應答的過程。
抗D免疫球蛋白最早在20世紀60年代用於預防同種免疫性溶血，有產時以及產前PSE等2個使用時機[9]。此後，隨著規範、足量的抗D血製品投入臨床應用，抗D免疫球蛋白也開始常規應用於臨床。近年來，美國由D抗原引起的HDFN的發生率從16%下降至0.5%[1]。但胎兒-母體輸血並不只發生於孕期PSE及產時，而實際在孕期最後6個月均可能發生。且隨孕周增加，進入母體的胎兒紅細胞數量也增多。研究表明，孕婦致敏主要發生在孕期最後12周；也有臨床研究證實，在孕期最後3個月常規應用抗D免疫球蛋白，對預防HDFN有較明顯的效果[9]。
統計顯示，大約每1 000例分娩中，就可有3例發生過量的胎兒-母體輸血。可用Kleihauer等檢查方法檢測胎兒-母體輸血，若結果為陽性，需進一步計算出血量，以判定常規的抗D免疫球蛋白劑量能否清除母體中的胎兒紅細胞。若出血量大，必要時應追加使用抗D免疫球蛋白，確保母體中無殘留的胎兒紅細胞激活免疫反應[7]。有報道顯示，在瑞典斯德哥爾摩地區，並沒有在PSE後常規檢測胎兒-母體輸血，也未追加使用抗D免疫球蛋白，但該地區RhD同種免疫發生率也很低（0.5%）。這一現象可能與抗D免疫球蛋白並不是靠清除所有胎兒RhD陽性紅細胞發揮作用，而可能具有阻止免疫反應起始階段的作用有關[9]。
抗D免疫球蛋白的作用機制目前尚未明確。2014年英國血液學標準委員會針對RhD陰性孕母致敏及新生兒溶血病發布了一項指南[7]，其中對抗D免疫球蛋白在孕期的使用方法做了詳細說明。該指南建議，在妊娠最後3個月和產後常規使用抗D免疫球蛋白；在28孕周前若出現PSE，需要臨時使用抗D免疫球蛋白，以阻斷免疫反應的發生。除英國外，目前還有一些國家針對抗D免疫球蛋白的使用制定了具體的指南[7,10-11]。這些指南中，關於抗D免疫球蛋白的使用原則相似，但就產前PSE包含的事件、早期流產的處理、產前是否常規預防使用抗D免疫球蛋白及應用的時間和劑量，以及胎兒-母體輸血檢查等方面的細節有所不同。目前日本並沒有由權威機構制訂的抗D免疫球蛋白應用指南，但RhD陰性母親分娩RhD陽性嬰兒後，一般常規使用抗D免疫球蛋白。不同醫療機構對早孕期流產後是否應用抗D免疫球蛋白，則持不同態度。雖然很多產科醫師建議在28孕周左右預防性使用抗D免疫球蛋白，但是該國衛生主管機構只建議在產後使用[10]。
有學者發現，用於母體的抗D免疫球蛋白可通過胎盤進入胎兒體內，這些抗體也有使胎兒發生溶血的風險。Maayan-Metzger等[12]發現，在足月RhD陽性新生兒中，有20%直接抗人球蛋白試驗陽性，但是並無發生溶血的證據。考慮到RhD陰性母親在28孕周時常規使用抗D免疫球蛋白，此時高抗體滴度可能會增加28孕周左右出生的早產兒的溶血風險。隨後在早產兒中進行的回顧性研究結果也未見溶血相關表現[13]。而在已經發生免疫反應的孕婦中使用抗D免疫球蛋白，將無法預防新生兒溶血的發生。有報道認為，可給予孕婦大劑量非特異性免疫球蛋白，以治療胎兒溶血[14]，但療效還有待進一步研究證實。

三、無創產前胎兒RhD基因分型
研究發現，RhD陰性者在白種人的比例較高，近40% RhD陰性血型孕母的胎兒血型也為RhD陰性[9]。對這些孕婦使用抗D免疫球蛋白是不必要的。若能早期明確胎兒的血型，就能避免反覆輸注抗D免疫球蛋白造成的資源浪費。Lo等[15]最先成功地在孕有RhD陽性胎兒的RhD陰性母體血中檢出RhD基因。進一步研究顯示，母體血中的胎兒DNA產生於滋養層的細胞凋亡過程，這部分DNA半衰期相對較短，保證了母血D抗原不會來自於前次妊娠[16]。此後，從母血中提取胎兒DNA成分，進而分析胎兒的血型的技術逐漸成熟起來。
在妊娠38 d，母體血中即可檢測出胎兒DNA；20孕周后，胎兒RhD DNA已可被聚合酶鏈擴增技術檢出[17]。該技術的關鍵點在於如何控制保證提取了足夠的胎兒DNA，以避免假陰性。當RhD陰性孕婦所妊娠胎兒的RhD基因型檢測結果為陰性時，尚不能完全判定胎兒為RhD陰性，需要繼續檢查，以確定母血中存在胎兒DNA[18]。可進行胎兒性染色體分析。若檢測出Y染色體的序列，則可認為存在胎兒DNA，即胎兒為RhD陰性。但如果胎兒為RhD陰性女性，則需測定單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）。SNP具有個體差異。由於胎兒繼承父源性的基因，胎兒的SNP與母體不完全相同。若92個SNP中有6個以上的不同，也可認定胎兒為RhD陰性。目前無創產前RhD基因型測定在許多歐洲及美國實驗室已成為常規項目。編碼D抗原的RhD基因結構複雜，存在不同的等位基因。RhD基因陽性、D抗原陰性等位基因稱為RhD無效等位基因。不同民族或種族中的RhD無效等位基因的分布不盡相同[19]。例如，高加索人和中國人以RhD-CE(2-9)-D2等位基因為主，而在黑人中RhDψ假基因則更為常見。在大部分高加索人及中國人中，RhD陰性表型者完全缺失RhD基因，此情況下RhD陰性母體血中檢測出RhD基因，即能推斷胎兒為RhD陽性。但是，非洲黑人RhD陰性人群中，無效等位基因的比例高達82%[20]，故對這些種族人群需要進行更加細緻的基因型分析。
為驗證無創產前胎兒RhD基因型測定的可行性，荷蘭在開展篩查項目後的第1年，產婦分娩後仍行臍血RhD血型鑒定。對比2項檢查結果後發現，在25 000例中，無創產前胎兒RhD基因型測定僅有8例（0.03%）為假陰性[9]。Tiblad等[21]在瑞典進行了一項大樣本量研究。該國此前產前未常規預防使用抗D免疫球蛋白。對照組的RhD陰性母親使用抗D免疫球蛋白的指征僅包括在產前進行了可能發生胎兒-母體輸血的有創檢查、12孕周后終止妊娠或產後，研究組則進行RhD基因型測定。若RhD陰性母親的胎兒血型為RhD陽性，則在28~30孕周常規預防性使用抗D免疫球蛋白。研究結果顯示，無創產前胎兒RhD基因測定聯合產前常規預防使用抗D免疫球蛋白後，RhD同種免疫發生率由0.46%下降至0.26%，差異具有統計學意義。英國從2002年起開始常規預防使用抗D免疫球蛋白預防HDFN。此後的研究顯示，在未檢測RhD基因型時，有38%的孕婦不必要地使用了抗D免疫球蛋白；而將RhD基因型檢測作為輸注抗D免疫球蛋白的指導後，使用抗D免疫球蛋白的比例下降至2%，並且RhD基因測定在近2 000例孕婦中僅有3例假陰性（0.2%）[22]。該檢測方法有效地減少了抗D免疫球蛋白的資源浪費。故可以認為，無創產前胎兒RhD基因型測定是應用抗D免疫球蛋白預防HDFN的一個重要環節。
四、抗D免疫球蛋白的製備

抗D免疫球蛋白能發現並清除母體血液循環中RhD陽性胎兒紅細胞，避免發生同種免疫反應。此外，抗D免疫球蛋白還可用於RhD血型鑒定，以保證同型血的輸注，在預防RhD血型不合所致的HDFN中意義重大。目前共有3種類型的抗D免疫球蛋白製劑，即多克隆抗體、單克隆抗體以及基因工程重組抗體。
最早的抗D免疫球蛋白為產自人血清的多克隆抗體。RhD陰性母親如在孕期發生免疫反應，其血漿中可產生大量抗體，這也是最初一代抗D免疫球蛋白的來源。但隨著抗D免疫球蛋白在預防HDFN中的普及運用，發生同種免疫反應的孕婦越來越少，抗體來源受限。此後的抗D免疫球蛋白主要通過免疫男性志願者製備得到。而為了維持志願者體內足夠的抗體滴度，常需要反覆多次注射RhD陽性紅細胞，以刺激免疫產生抗體。血漿來源免疫球蛋白一直存在著病毒傳播的安全性問題，特別是20世紀初，變異的克-雅病病毒在血漿製品中的傳播，使研究者努力尋找其他可大規模生產的、安全可靠的可替代抗體[23]。在這種情況下，產生了單克隆抗體及基因工程抗體。它們都源自人免疫球蛋白基因或人B細胞，但表達系統各異，如人B細胞系、中國倉鼠卵巢細胞、人鼠雜交瘤及鼠骨髓瘤等。在過去的幾十年間，多種單克隆及基因工程抗體均進行了0期臨床試驗，主要評估各抗體清除RhD陽性紅細胞以及阻斷RhD免疫反應的能力。研究結果顯示，這些抗體的效果各異：有2個源自人B淋巴細胞系的單克隆抗體，可以有效清除紅細胞、阻斷免疫反應，效果與多克隆抗體幾乎相同，但是需要更大的劑量。一些基因工程抗體的紅細胞清除情況則遠不如多克隆抗體，並且清除效果不隨抗體劑量增加而發生變化。其中一種源自人鼠雜交瘤細胞的單克隆抗體在清除紅細胞方面的效果不穩定，甚至可能增強了RhD免疫反應，甚至有1例發生嚴重溶血反應[24]。Rozrolimupab是由針對RhD抗原的、由25種單克隆抗體混合而成的新型重組抗體，在健康男性志願者的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中，未發現明顯的不良反應，且紅細胞清除率與血漿來源的多克隆抗體相仿[25]，具有良好的應用前景。目前該抗體用於HDFN的Ⅱ期臨床試驗正在進行中，其效果及安全性還需進一步數據證實。
單克隆及基因工程抗體在預防HDFN的方面，距離廣泛投入臨床應用，還有明顯距離。目前抗D免疫球蛋白在國內並未常規使用。雖然漢族人群RhD陰性者僅佔0.34%，但一些少數民族，如維吾爾族和塔吉克族人群中，RhD陰性者分別為5%和15%[26]。我國人口基數大，且現全球人口流動性增大。隨著相關生育政策的調整，RhD血型不合溶血病在國內的發生率可能進一步升高，抗D免疫球蛋白在國內常規使用已刻不容緩。抗D免疫球蛋引入國內市場後，考慮到經濟、有效地預防HDFN的需要，提出如下建議。（1）孕婦在首次產前檢查時，應查明RhD型別，及是否已產生同種免疫反應。對RhD陰性、尚未產生抗體的孕婦，推薦孕期使用抗D免疫球蛋白。（2）無創產前胎兒RhD基因型的測定可協助判斷抗D免疫球蛋白使用的必要性。（3）有關抗D免疫球蛋白的具體使用時機及劑量，推薦參考英國2014年的使用指南[7]。（4）若高度懷疑產生了過量的胎兒-母體輸血，在這一事件發生後應行相關檢查，必要時追加使用抗D免疫球蛋白。