細菌耐葯機制與臨床治療對策

細菌耐葯機制與臨床治療對策　　　細菌對抗菌藥物的耐藥性是自然界的抗生現象。每一種抗菌藥物進入臨床後伴隨而來的是細菌的耐葯，即細菌在藥物高於人類接受的治療劑量濃度下能生長繁殖。這種耐葯可能與整個種的固有特性有關，也可能出現在正常敏感菌種內，通過變異或者基因轉移獲得。耐葯基因決定了各種各樣的機制，使細菌抵抗特定抗菌藥物的抑制作用。一、細菌耐葯機制細菌主要通過四種方式抵制抗菌藥物作用，產生滅活酶或鈍化酶，使抗菌藥物失活或結構改變；抗菌藥物作用靶位改變或數目改變，使之不與抗菌藥物結合；改變細菌細胞壁的通透性，使之不能進入菌體內；通過主動外排作用，將藥物排出菌體之外。另外，細菌分泌細胞外多糖蛋白複合物將自身包繞形成而細菌生物被膜，也是導致耐葯的原因之一。這些耐葯機制不是相互孤立存在的，兩個或更多種不同的機制相互作用決定一種細菌對一種抗菌藥物的耐藥水平。（一）細菌產生滅活酶或鈍化酶細菌可產生滅活酶或鈍化酶，並以此來破壞各種抗菌藥物。目前，細菌產生的滅活酶或鈍化酶主要是β-內醯胺酶、氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶、氯黴素乙醯轉移酶和MLS（大環內酯類—林克黴素類—鏈陽菌素類）類抗菌藥物鈍化酶，其中人們對β-內醯胺酶研究最為深入。1、β-內醯胺酶：β-內醯胺酶根據各自的氨基酸序列可分為A、B、C、D共4種分子類別，按照各自的底物、抑製劑及分子結構分為4組，第1組是不被β-內醯胺酶抑製劑克拉維酸抑制的頭孢菌素酶，分子量大於30kD，分子類別屬C類。大部分由染色體介導，但近年來發現也可由質粒介導。第2組為可被克拉維酸抑制的β-內醯胺酶，為數量最多的一組，一半以上由質粒介導。根據對青黴素類、頭孢菌素類、肟類β-內醯胺、氯唑西林、羧苄西林和碳青黴烯類抗菌藥物的水解活性分為2a、2b、2be、2c、2d、2e共6個亞組；最近發現的不能被克拉維酸抑制的TEM型酶和染色體介導的A類碳青黴烯酶分屬於2br和2f亞組。除2d的分子類別為D類外，其餘各亞組分子類別均為A類。第3組酶的作用需要金屬離子如Zn2+的參與，故稱為金屬β-內醯胺酶。分子類別屬B類，不被克拉維酸抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。第4組包括少量青黴素酶，不被克拉維酸抑制，主要由染色體介導。本組分子類別未知。多數臨床常見致病菌可產生β-內醯胺酶，由革蘭陽性菌產生的β-內醯胺酶以葡萄球菌屬產生的青黴素酶最重要，而在革蘭陰性菌中，超廣譜β-內醯胺酶（ESBLs）愈來愈受到重視。第三代頭孢菌素因為擁有氨基噻唑－甲氧氨基側鏈來對抗導致早期對b－內醯胺類抗菌藥物耐葯的b－內醯胺酶，人們認為這些抗菌藥物不可能與b－內醯胺酶的活性部位結合，將它們稱為「超廣譜b－內醯胺類抗菌藥物」 ，所以把能水解這些「超廣譜b－內醯胺類抗菌藥物」的b－內醯胺酶叫作「超廣譜b－內醯胺酶」。超廣譜b－內醯胺酶對甲氧亞氨基b－內醯胺類抗菌藥物如頭孢他啶、頭孢噻肟以及單氨類抗菌藥物如氨曲南等藥物一種或多種耐葯，主要由腸桿菌科細菌如肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希氏菌等細菌產生，ESBLs大部分由質粒介導，除TEM型及SHV型衍生的b－內醯胺酶以外，ESBLs還包括PER型酶、CTX型酶及K1、TOHO-1、 MEN-1、VEB-1等型酶。近年來，在革蘭陰性桿菌中高水平表達的染色體介導的AmpC酶已漸成為臨床上面臨的嚴重治療問題。AmpC酶為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶，可引起革蘭陰性桿菌對第三代頭孢菌素及單環類抗生素耐葯。AmpC酶以誘導酶和非誘導酶存在於不同的細菌中，大部分腸桿菌屬和銅綠假單胞菌擁有染色體介導的Class1b－內醯胺酶，陰溝腸桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、銅綠假單胞菌在缺乏b－內醯胺類抗生素時，只產生少量的b－內醯胺酶，當有誘導作用的b－內醯胺類抗生素存在時，b－內醯胺酶的產量明顯增加，因而這類酶又叫誘導酶。AmpC酶的誘導具有菌種依賴性、誘導劑依賴性及誘導條件依賴性。酶誘導後增加的範圍在100—1000倍之間。AmpC酶的表達受amp複合操縱子調控，amp操縱子由4個不連鎖酌因即ampC、ampR、ampD和ampG組成，ampC是AmpC酶的結構基因；ampR編碼誘導性轉錄調控因子；ampD編碼一種新的N—乙醯葡搪胺—L—丙氨酸醯胺酶；ampG編碼膜結合轉運蛋白；目前研究發現，AmpC酶出現由原來局限於染色體編碼逐漸向質粒編碼轉移趨勢，大大提高了AmpC酶的橫向傳播能力。2、氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶氨基糖苷類抗菌藥物鈍化酶可修飾抗菌藥物分子中某些保持抗菌活性所必須的基團，使其與作用靶位核糖體的親和力大為降低。這些鈍化酶包括氨基糖苷醯基轉移酶、氨基糖苷腺苷轉移酶或氨基糖苷核苷轉移酶和氨基糖苷磷酸轉移酶等。（二） 細菌藥物作用靶位改變1、β-內醯胺類抗菌藥物作用靶位改變：β-內醯胺類是臨床最常用的抗菌藥物，其作用靶點是青黴素結合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs）。PBPs是一組位於細菌內膜、具有催化作用的酶，參與細菌細胞壁的合成、形態維持和細菌糖肽結構調整等功能。目前研究發現的由PBPs改變而引起的耐葯細菌主要有葡萄球菌、肺炎鏈球菌以及銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟氏球菌等G-細菌。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus ,MRSA)的耐葯機製為產生PBP2a，其中PBP2a對β-內醯胺類藥物親和力很低，分子量為78kDa，當β-內醯胺類藥物以共價結合的方式使正常的4種主要PBPs失活，PBP2a可替代完成細胞壁合成的功能，從而產生耐葯。表皮葡萄球菌中也存在耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus epidermidis ,MRSE)，其耐葯機制與MRSA相同。肺炎鏈球菌有6種PBPs，PBP1a/1b(100kDa)、PBP2a/2x/2b(95-78kDa)、PBP3(43kDa)。在耐青黴素肺炎鏈球菌(penicillin resistant streptococcus pneumoniae ,PRSP)中，PBP1a、2a、2x、2b對β-內醯胺類藥物的親和力下降。由於G-細菌的產酶耐葯機制和通透性改變等耐葯作用明顯，PBPs在其耐葯機制中的作用並不顯要。實驗室研究發現銅綠假單胞菌的PBP3，不動桿菌的PBP1、PBP2、PBP5，流感嗜血桿菌的PBP3、PBP4、PBP5，淋病奈瑟氏球菌的PBP1、PBP2，腦膜炎奈瑟氏球菌的PBP2與其耐β-內醯胺類抗菌藥物有關。目前在其他G-細菌，如腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬以及大腸埃希菌中，尚未發現與PBPs有關的耐藥性。2、萬古黴素作用靶位改變：萬古黴素是一種高分子量的糖肽類抗菌藥物，它和革蘭氏陽性菌的細胞壁肽聚糖前體五肽中的D-丙氨酸-D-丙氨酸末端（D-ala-D-ala）結合，抑制細菌細胞壁蛋白合成。絕大多數臨床的革蘭氏陽性菌，均對萬古黴素敏感。萬古黴素也是治療MRSA臨床感染的最為有效的抗菌藥物。但因為臨床上萬古黴素的大量使用及其在使用中的不合理現象，導致了耐萬古黴素腸球菌（vancomycin resistant enterococus ,VRE）的出現。VRE可通過DNA獲得質粒或轉座子以及突變株的發生，而產生耐藥性。根據VRE在對萬古黴素和替考拉寧耐藥水平、可誘導性和可轉移性上的差異，可以將已出現的VRE分為4種表型：VanA，VanB，VanC和VanD。其耐葯機制主要與萬古黴素結合靶位改變有關。如VanA，其耐葯基因位於轉座子Tnl546上，易於轉移，並且伴隨vanA基因編碼生成多種功能蛋白，包括VanA、VanH、VanS、VanR、VanX、VanY，VanS是膜感測蛋白，可檢測到環境中萬古黴素的存在，探測到後，VanS就會嚮應答蛋白VanR發出信號，後者再激活與耐葯功能相關的VanH、VanA、VanX的合成。VanH是一種產生D—乳酸的脫氫酶。VanA蛋白是D—乳酸：D—丙氨酸連接酶，它催化生成D-ala—D-lac二肽，代替了正常肽聚糖合成五肽前體中的D-ala—D-ala二肽。D-ala—D-lac在細胞自身染色體編碼的酶的作用下與UDP-NAM三肽連接生成新的UDP-NAM五肽前體。萬古黴素對該五肽的親和力很低，無法再與之結合，從而細菌對萬古黴素產生耐葯。VanX蛋白則是存在於細胞質中的D，D—二肽酶，它解離已生成的D-ala—D-ala，而不水解D-ala—D-lac或含D-ala—D-lac的五肽前體，從而進一步阻止含D-ala—D-ala肽聚糖的正常前體的合成。如果有部分D-Ma—D-ala逃過了VanX蛋白的水解作用而合成了正常的肽聚糖前體五肽，那由 vanA基因簇編碼產生VanY蛋白(羧肽酶)仍可以將正常的肽聚糖前體五肽的末端殘基(如D-ala)解離，生成一種萬古黴素不能與之結合的四肽，而產生對萬古黴素耐藥性。3、大環內酯類、林可黴素、鏈陽菌素、四環素類、氨基糖苷類藥物作用靶位改變：此類藥物主要通過與細菌核糖體結合，抑制細菌蛋白質合成，而發揮抗菌作用。細菌核糖體由大亞基（50s）、小亞基(30s)構成，亞基中mRNA及蛋白質的改變，可引起與抗菌藥物親和力的變化，而產生對上述幾類藥物的耐藥性。大環內酯耐葯菌可合成甲基化酶，使位於核糖體50S亞單位的23SrRNA的腺嘌呤甲基化，導致抗菌藥物不能與結合部位結合。因大環內酯類抗菌藥物、林可黴素及鏈陽菌素的作用部位相仿，所以耐葯菌對上述3類抗菌藥物常同時耐葯，稱為MLS(macro1ide，lincosamide，streptogramins)耐葯。此類耐葯菌的耐葯基因為位於質粒或染色體上的erm（erythromycin resistance methylase）基因，目前至少已發現8類erm基因，常見的有ermA、ermC(葡萄球菌屬耐葯基因)，ermAM(鏈球菌屬耐葯基因)。細菌對四環素耐葯的主要原因之一是，細菌產生基因tetM編碼的6.8×103及7.5×103的可溶性蛋白，該蛋白與核糖體結合，保護核糖體或其他決定簇，從而阻止四環素對蛋白合成的抑制作用。該基因亦與多西環素、米諾環素耐葯有關。細菌對氨基糖苷類耐葯的主要原因是細菌產生鈍化酶，而有些細菌也可通過編碼核糖體蛋白的基因突變導致核糖體結構改變，從而阻止細菌與抗菌藥物的結合，如抗藥結核分支杆菌、金葡菌、大腸埃希菌等對鏈黴素的耐葯。4、利福黴素類作用靶位改變：利福黴素類通過與RNA聚合酶結合，抑制細菌轉錄過程，而到達抗菌效果。耐利福黴素細菌，如大腸埃希菌、結核分支杆菌，編碼RNA聚合酶β亞基的基因（rpoB）可產生突變，導致其不易與利福黴素類藥物相結合，而產生耐葯。5、喹諾酮類藥物作用靶位改變：喹諾酮可抑制DNA拓撲異構酶活性，阻止DNA複製、修復，染色體分離、轉錄及其他功能，從而發揮殺菌作用。DNA拓撲異構酶Ⅱ又常稱為DNA旋轉酶，其基因突變可引起耐葯，以大腸埃希菌為顯著。大腸埃希菌gryA基因序列上，殘基67—106區域常發生突變，因而命名為喹諾酮類藥物耐葯區(QRDR)。gryA的改變產生耐葯可能有兩種解釋，一種是由於酶結構的改變引起空間上的障礙，阻止喹諾酮進入喹諾酮作用區；另一種是由於物理、化學變化干擾喹諾酮-酶-DNA相互作用。每一種gryA突變都可造成對喹諾酮類中所有藥物交叉耐葯。因DAN旋轉酶改變而對喹諾酮類抗菌藥物產生耐葯的細菌還有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸桿菌屬和假單胞菌等。DNA拓撲異構酶Ⅳ的改變，產生對藥物的低水平耐葯。當拓撲異構酶Ⅱ、Ⅳ均發生變化，則耐葯程度更大。6、磺胺類藥物作用靶位改變：由於細菌不能使用外源性葉酸，磺胺類藥物可通過抑制二氫葉酸合成酶或二氫葉酸還原酶，使細菌發生葉酸代謝障礙，而發揮抑菌作用。耐磺胺類藥物的細菌的二氫葉酸合成酶或二氫葉酸還原酶與磺胺類藥物親和力降低，或靶位酶的合成量增加。（三）細菌細胞膜滲透性改變細菌細胞膜與細胞的細胞膜相似，是一種具有高度選擇性的滲透性屏障。細胞外膜上的某些特殊蛋白，即膜孔蛋白（porin）是一種非特異性的、跨越細胞膜的水溶性擴散通道。抗菌藥物也可通過這些膜孔蛋白進入菌體內部，發揮效用。而某些細菌由於膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使某些抗菌藥物不能進入菌體內部，產生所謂「內在性耐葯」或稱「固有性耐葯」(intrinsicallyresistant)，即這種耐葯並非是由於任何染色體的突變或是耐葯質粒的獲得所致。如銅綠假單胞菌的細胞外膜上沒有大多數革蘭氏陰性細菌所具有的典型的高滲透性孔蛋白，它的孔蛋白通道對小分子物質的滲透速度僅為典型孔蛋白通道的1／100。一些具有高滲透性外膜的對抗菌藥物原來敏感的細菌可以通過降低外膜的滲透性而發展成為耐藥性，如原來允許某種抗菌藥物通過的孔蛋白通道由於細菌發生突變而使該孔蛋白通道關閉或消失，則細菌就會對該抗菌藥物產生很高的耐藥性。此種耐葯機制往往對抗菌藥物特異性較差，具有多重耐藥性，因此，相對來說，臨床選擇有效藥物的難度更大。

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