第四章 病毒和亞病毒

大跳蚤的背上有小跳蚤，而小跳蚤的背上又有更小的跳蚤，以至無窮。

——Augustus De Morgan

病毒只能在活細胞內增殖，或專性活細胞內寄生。

獲得諾貝爾獎的病毒方面的研究：

1954年 在組織培養中培養脊髓灰質炎病毒。

1966年 癌病毒的發現

1969年 發現病毒和細胞的病毒感染

1975年 發現RNA腫瘤病毒依賴於RNA的DNA合成；DNA腫瘤病毒的繁殖

1976年 乙型肝炎病毒起源和傳播的機理、慢病感染研究

1997年 朊病毒的發現

第一節 病毒

病毒：是一類由核酸和蛋白質等少數幾種組分組成的超顯微「非細胞生物」，本質是一種只含DNA或RNA的遺傳因子。

能以感染態和非感染態兩種狀態存在。

病毒的化學組成：由蛋白質和核酸組成，有的病毒還含有類脂質和多糖。

▲每種病毒只含一種核酸（遺傳物質），要麼是RNA，要麼是DNA。大多數是RNA，少數是DNA；噬菌體例外（大多數是DNA）。

▲ 病毒的主要特徵：

（1）形體極其微小（10~300nm），必須在電鏡下才能觀察，一般都能通過細菌過濾器。

（2）沒有細胞構造，主要成分僅為核酸和蛋白質兩種，故也稱「分子生物」、「非細胞生物」。

（3）每一種病毒只含一種核酸，不是DNA就是RNA。

（4）既無產能酶系也無蛋白質合成酶系，只能利用宿主代謝系統合成自身的核酸和蛋白質。

（5）以蛋白質和核酸等元件的裝配實現其大量繁殖。

（6）在離體條件下，能以無生命的化學大分子狀態存在，並長期保存其侵染能力。

（7）對一般抗生素不敏感，但對干擾素敏感。

（8）病毒的核酸還能整合到宿主的基因組中，誘發潛伏性感染。

一、病毒的形態構造和化學成分

（一）病毒的大小

個體微小，能通過細菌過濾器，必須用電子顯微鏡才能觀察到，以nm為測量單位。病毒、細菌和真菌這三類微生物個體直徑比大約為1:10:100。

（二）病毒的形態

1、典型病毒粒的構造

球狀：球狀病毒(或多面體病毒)。動物病毒多為球狀。

桿狀：桿狀病毒(包括棒狀或線狀)。植物病毒多呈桿狀。

蝌蚪狀：蝌蚪狀病毒。細菌病毒多呈蝌蚪狀。

由於病毒是一類非細胞生物，所以病毒個體不能稱作「單細胞」，而用病毒粒（或病毒顆粒）或病毒體表示。

▲ 病毒粒（或稱病毒顆粒）專指成熟的、結構完整的和有感染性的單個病毒。

病毒粒的主要成分：核酸和蛋白質。

l 核酸位於病毒粒的中心，構成了它的核心或基因組；

l 蛋白質包圍在核心周圍，形成衣殼，對核酸有保護作用。

l 核心和衣殼合稱核衣殼，它是任何真病毒都具有的基本結構。

2、病毒粒的對稱體制

病毒粒的對稱體制只有兩種：螺旋對稱和二十面體對稱（等軸對稱）。

螺旋對稱：能使核酸與蛋白亞基間的接觸更緊密；

二十面體對稱：有利於核酸以高度捲曲的形式包裹在衣殼中。

複合對稱：

3、病毒的群體形態

當大量病毒粒子聚集在一起並使宿主細胞發生病變時，就可觀察到群體形態。 如動物、植物細胞中的病毒包涵體、噬菌體的噬菌斑、植物葉片上的枯斑。

（1）包涵體

分布：細胞質或細胞核內，或細胞質、細胞核中都存在。

應用：① 病毒診斷；② 用於生物防治。

（2）噬菌斑

噬菌體侵染細菌細胞，導致寄主細胞溶解死亡，因而在瓊脂培養基表面形成的空斑（「負菌落」）。

? 每個噬菌斑一般是由一個噬菌體粒子形成的。

? 噬菌斑可用於檢出、分離、純化噬菌體和進行噬菌體的計數。

病毒的生長並不總是造成細胞裂解形成噬菌斑，尤其是動物病毒還可引起宿主細胞和組織微觀或者宏觀的變化和異常，稱為致細胞病變效應。

病毒還能以透射電子顯微鏡直接計數。

（3）空斑和病斑

在動物細胞培養物上的與噬菌斑類似的空斑，稱為病斑。

（4）枯斑

植物葉片上的植物病毒群體。

大豆葉上枯斑 花生葉上枯斑

（三）三類典型形態的病毒及其代表

1、螺旋對稱的代表——煙草花葉病毒（TMV）

TMV是發現最早、研究最深和了解最清楚的一種病毒。衣殼粒和核酸呈螺旋對稱形排列，其外形呈直桿狀。

2、二十面體對稱的代表——腺病毒

一種動物病毒，其宿主包括人和各種動物。 沒有包膜，有12個角，20個面，30條棱。外形呈球形。腺病毒核心是線狀雙鏈DNA（dsDNA），其基因組的大小約為36500個核苷酸對。

3、複合對稱的代表——T偶數噬菌體

細菌病毒又稱噬菌體（phage）（p68），是侵染細菌的病毒。它們是專性細胞內寄生物，可以噬菌體顆粒在細菌細胞外存在，但只能在細胞內繁殖。

噬菌體具有侵染細菌的能力，而且在細胞內指令合成噬菌體的成分。

大腸桿菌的T偶數噬菌體共有三種，即T2、T4和T6。它們在自然界分布極廣，是分子生物學研究中的極好材料。

T4由頭部、頸部和尾部三部分構成。由於頭部呈二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱，所以T4是一種複合對稱結構。

T偶數噬菌體雖呈蝌蚪狀，但吸附卻是通過尾絲。尾絲吸附後，會使基板受到構型的刺激，接著尾鞘蛋白髮生收縮，使尾管插入宿主細胞。尾管中空 是頭部核酸注入宿主細胞的通道。

刺突：6個，具吸附功能；

尾絲：6根，由蛋白構成，折成等長的兩段，具吸附專一性。

噬菌體由核酸基因組和四周稱為衣殼的蛋白質外殼包圍而構成，衣殼蛋白具有保護遺傳物質和幫助侵染新的宿主的作用。外殼是由結構蛋白亞單位所組成，給噬菌體以特別明顯的形狀。

（四）病毒的化學組成

1、病毒的核酸

核酸構成病毒的基因組。病毒基因組在大小、結構和核苷酸的組成上是多種多樣的，有RNA、DNA、線狀、環狀、閉環、缺口環、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、單鏈RNA (ssRNA)、分段或者不分段的。

動物病毒以線狀的dsDNA和ssRNA居多；

植物病毒以ssRNA居多；

噬菌體以線狀的dsDNA居多。

病毒的基因組攜帶有作為病毒遺傳密碼的核酸序列。在被感染的細胞中，基因組被轉錄和翻譯成氨基酸序列，並組成了病毒的結構蛋白和非結構蛋白。

2、病毒的蛋白

結構蛋白：是核衣殼、基質，或者是包膜中的蛋白。這些蛋白對病毒基因組起保護作用。

非結構蛋白：包含在病毒體內的非結構蛋白，通常具有酶的活性，對啟動病毒的感染是必要的。

病毒蛋白，無論是結構蛋白（衣殼、包膜）還是非結構蛋白都是由病毒的基因組編碼的。

3、脂類和糖類

脂類：一些磷脂、膽固醇和中性脂肪，多數存在於包膜。

糖類：主要是葡萄糖、龍膽二糖、岩藻糖、半乳糖等。

4、病毒的包含體

有的病毒在寄主細胞內形成包含體結構，它們多數位於細胞質內，具嗜酸性；少數位於細胞核內，具嗜鹼性；也有細胞核內和細胞質都存在的類型。

寄主細胞被病毒感染後形成的蛋白質結晶體，內含有1至幾個病毒粒子。

二、四類病毒及其繁殖方式

（一）原核生物的病毒——噬菌體

噬菌體即原核生物的病毒，包括噬細菌體、噬放線菌體和噬藍細菌體等。

據Bradley（1967）歸納，噬菌體共有6類形態。

1、噬菌體的繁殖

繁殖：病毒侵入寄主細胞後，利用寄主細胞提供的原料、能量和生物合成機制，在病毒核酸的控制下合成病毒核酸和蛋白質，然後裝配為病毒顆粒，再以各種方式從細胞中釋放出病毒粒子的過程。又稱為複製。

病毒粒不存在生長過程。同種病毒粒之間不存在年齡和大小之分。

▲烈性噬菌體（Virulent phage）：侵入寄主細胞後進行複製繁殖，並導致細胞裂解的噬菌體。

▲溫和性噬菌體（Temperate phage）：侵入細胞後與宿主細胞同步複製，並隨宿主細胞的生長繁殖而傳代下去，在一般情況下不引起宿主細胞裂解的噬菌體。

溫和噬菌體特點：① 都是dsDNA；② 溶源菌。

（1）吸附

吸附：噬菌體用尾絲的末端吸附在相應的宿主的表面。

噬菌體通過附著在細胞表面的特異性受體(蛋白質或多糖)侵染宿主。

吸附過程決定於：

a、細胞表面受點的結構；b、噬菌體的吸附器官；c、溫度等。

一種細菌細胞表面可被多種和多個噬菌體吸附感染。一般情況下，一個細菌表面吸附250~ 360個噬菌體達到飽和量。

大腸桿菌表面吸附的T4噬菌體

（2）侵入

噬菌體以尾部固著于敏感細菌細胞表面，將尾絲展開固著於細胞，尾部的溶菌酶水解宿主細胞壁的肽聚糖，使細胞壁產生一個小孔，然後尾鞘收縮，將頭部的核酸通過中空的尾髓壓入細胞內，而蛋白質外殼則留在細胞外。此過程可在幾十秒內完成。

v 只有遺傳物質注射進入宿主，留下空蛋白外殼在胞外。

v 通常一種細菌可同時受到幾種噬菌體的侵染，但只允許一種噬菌體進入細胞。往往先進入的噬菌體可排斥或抑制後進入者。即使進入了，後進入者也會因不能增殖而消亡。

（3）增殖

包括噬菌體核酸的複製和蛋白質的合成。

烈性噬菌體的複製：噬菌體進入宿主細胞後立即以噬菌體DNA為模板，利用宿主原有的RNA合成酶合成出早期的mRNA，由早期mRNA翻譯成早期蛋白質。然後開始噬菌體核酸的複製。在DNA開始複製後轉錄的mRNA為晚期mRNA，再由晚期mRNA翻譯成晚期蛋白質即噬菌體外殼的結構蛋白，如頭部蛋白質、尾部蛋白質。

（4）成熟（裝配）

把已經合成的各種「部件」 裝配成一個成熟的、有侵染力的噬菌體粒子的過程。

過程：先是DNA的凝聚，頭、尾和尾絲各自組成。然後按從頭到尾的順序自我裝配，形成一個完整的噬菌體。

（5）釋放

釋放——子代噬菌體由於細菌的裂解而被釋放出來，再去侵染其它的細菌。

裂解：脂肪酶水解細胞膜、溶菌酶水解細胞壁

大腸桿菌的T偶數噬菌體從吸附到粒子成熟釋放大約需要15 ~30 min。

可見，病毒分兩個階段存在：胞外階段（病毒粒形式）和胞內階段。

2、噬菌體效價的測定

效價：指每毫升試樣中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數，又稱噬菌體斑形成單位數。PFU

噬菌斑 /空斑/「負菌落」 根據噬菌斑的形狀可做鑒定指標。

噬菌斑的形狀

測定效價方法很多，較常用且較精確的方法是雙層平板法。p72

操作方法：

優點：

3、一步生長曲線

由Max Delbruck 和Emory Ellis於1939年建立的一步生長實驗，標誌著現代噬菌體研究的開始。

利用烈性噬菌體 的生活周期測定噬菌體侵染和成熟病毒體釋放的時間間隔，用於估計每個被侵染的細胞釋放出來的新的噬菌體粒子數量的生長曲線，稱為一步生長曲線。

（1）潛伏期

指從噬菌體吸附到宿主細胞開始，到宿主細胞釋放第一個成熟的噬菌體為止的一段時間。包括了吸附、侵入、生物合成和裝配階段。 包括隱晦期和胞內積累期。

隱晦期：宿主細胞內不含任何完整的、有感染性的毒粒。

胞內積累期：感染毒粒增加，但不釋放任何毒粒。

（2）裂解期

指噬菌斑突然上升的時期，即細菌細胞正被大量裂解。

（3）平穩期

指感染後的宿主細胞已經全部裂解，溶液中噬菌體效價達到最高點的時期。

可見，一步生長曲線定量描述了烈性噬菌體的生長規律。它可反映每種噬菌體的3個重要特性參數：潛伏期、裂解期和裂解量。

裂解量：是每個感染細菌所釋放的新噬菌體的平均數量。

當37℃大腸桿菌被T4噬菌體感染後，大約30 min達到生長高峰，裂解量為大約每個細胞產生100個或更多個毒粒。隱晦期長約11~12 min，潛伏期長21~22min左右。

一步生長曲線的基本實驗步驟： p73

為什麼可以隔時取樣測效價？敏感細菌如E.coli 的培養物與噬菌體顆粒混合，噬菌體在短時間內吸附於它們的宿主細胞。然後高倍稀釋該培養物，以至任何從宿主細胞裂解中釋放的病毒顆粒不會立即感染新的細胞。這種策略是可行的，因為噬菌體沒有找到宿主細胞的主動途徑，而必須通過溶液的隨機運動接觸宿主細胞，因而在稀釋的混合物中噬菌體多數不能接觸到宿主細胞。然後可以在不同時間間隔取樣用噬菌斑計數的方法檢測從細菌中釋放的感染性噬菌體的數目。

4、溶源性

▲溶源性：是溫和噬菌體侵入後並不立即引起宿主細胞裂解的特性。

溫和性噬菌體侵入到宿主細菌細胞後，其DNA可整合到宿主細胞的染色體上，並隨宿主細胞染色體DNA的複製而進行同步複製，但不合成自己的蛋白質殼體，宿主細胞不裂解而能繼續生長。

凡能引起溶源性的噬菌體稱為溫和性噬菌體/原噬菌體；

含有溫和性噬菌體的宿主細胞稱為溶源性細胞。溶源菌。

各種細菌、放線菌都有溶源菌。

λ噬菌體是迄今研究得最清楚的一種溫和噬菌體。

溶源性細胞/溶源菌的特性的特性：

（1）溶源細胞的裂解

（2）溶源細胞的免疫性

? 溶源菌中有一種阻遏蛋白，阻遏蛋白能阻遏進入溶源菌的其它同型噬菌體的基因組，使其不能在該細胞內複製。也就是說，它們對於相同病毒的再感染具有免疫性。因此溶源細菌對同型噬菌體呈現一種特異的「免疫」現象。

（3）溶源性細菌的復愈

? 溶源性細菌細胞有時可在無理化因子影響條件下既不發生自發裂解，也不發生誘發裂解而消失其含有的溫和噬菌體，成為非溶源性細胞，稱為溶源細胞的復愈或非溶源化。

（4）溶源性轉換

? 溫和噬菌體可誘導宿主細胞表型改變，這種改變與其生命周期是否完成沒有直接關係，這種改變稱為溶源性轉變。通常涉及細菌表面特徵、或致病性的改變。

例如，當沙門氏菌被一種ε噬菌體感染後，其外層脂多糖層結構可能被修飾，這種噬菌體改變了與脂多糖中糖類組分構成有關的幾種酶的活性，從而改變了宿主的抗原性，這種ε噬菌體誘導的改變消除了表面的噬菌體受體，可阻止其它ε噬菌體對溶源菌的感染。

溫和噬菌體的三種存在形式：

? 遊離態：指成熟後被釋放並具有浸染性的遊離噬菌體粒子。

ü 整合態：已整合到宿主基因組上的狀態。 此時的噬菌體又稱為前噬菌體

即：溶源菌內噬菌體基因組的潛伏形式為原噬菌體

· 營養態：前噬菌體經外界理化因素誘導後，脫離宿主核基因而處於積極複製、合成和裝配的狀態。

噬菌體毒性感染和溶源性過程圖

溫和噬菌體特點：

① 細菌的溶源性具有遺傳性，產生子代細胞也具有溶源性；

② 有少數噬菌體可自發裂解or誘發裂解宿主細胞；

③ 溶源性細菌在培養中一般不易被察覺，只有用非溶源性敏感菌株混合培養在培養基上形成噬菌斑才可被覺察到。

檢驗某菌株是否為溶源菌的方法：p73

小結：在某些條件下有產生噬菌體顆粒潛力的細菌被稱為溶源菌或溶源體；能進入這種關係中的噬菌體是溫和噬菌體。保留在宿主細胞中，但不損傷宿主的病毒基因組潛伏形式稱為原噬菌體。原噬菌體通常被整合入細菌基因組，但有時也獨立存在。誘導是在溶源化培養中啟動噬菌體複製的過程，可以導致感染細菌破壞，並釋放出新的噬菌體，即裂解周期的誘導。

（二）植物病毒

1、概述

是最先發現、提純結晶和電鏡觀察到的病毒。已知植物病毒有700多種(1989)，多數是單鏈RNA病毒，一般無包膜。

植物染毒後，癥狀主要有三種：

① 葉綠體不能行使正常功能而引起花葉、黃化或紅化等；

② 植株發生矮化，叢枝或畸形等；

③ 形成枯斑或壞死等癥狀。

2、「侵入」方式

本身沒有特殊吸附結構。

（1）借昆蟲刺吸式口器刺破植物表面侵入；

（2）通過植物的天然創口或人工嫁接時的創口侵入；

（3）通過胞間連絲或輸導組織迅速擴散而引起普遍感染。

（三）人類和脊椎動物病毒

? 病毒在人體與哺乳動物中普遍存在，其它各類動物中也廣泛存在著相應的病毒。

? 家畜中的口蹄疫、豬瘟、牛瘟、馬傳染性貧血、兔乳頭狀瘤等；

? 家禽中的瘟疫病，兩棲類、魚類的腫瘤、魚痘等都是病毒引起的；

? 人類80％的傳染病（如流行感冒、肝炎、麻診、水痘、腮腺炎、流行性乙型腦炎、脊髓灰質炎、狂犬病等）是受病毒感染而誘發的。

? 這些病毒病至今還缺少有效的對付手段，它們大量增殖，導致宿主細胞裂解死亡。

導致細胞死亡的感染稱為殺細胞感染。

動物病毒可以多種方式損傷宿主細胞，經常導致細胞死亡。

持續、潛伏和慢性毒感染：

許多病毒感染為急性感染，即發病相當快而持續時間相對短。

然而有些病毒可以產生持續感染，持續數年時間。

潛伏病毒感染，病毒處於潛伏狀態，沒有癥狀、沒有相應抗體、沒有病毒檢出。例如單純皰疹病毒。

持續和潛伏感染的精確機理並不清楚。

有一小類病毒可產生極慢過程的感染。慢性病毒感染中，病毒幾乎一直可以檢出，臨床癥狀輕微或長時間不出現臨床癥狀。例如HBV病毒和HIV病毒。

? 一些病毒感染動物後，並不致死宿主細胞，而是引起腫瘤。人的腫瘤特別是惡性腫瘤已證明不是由病毒引起，但病毒可誘導人產生惡性腫瘤。

艾滋病：獲得性免疫缺陷綜合症（AIDS）。

HIV病毒：人類免疫缺陷病毒，引起艾滋病的病毒。

HIV病毒 SARS冠狀病毒的結構示意圖

禽流感病毒 乙型肝炎病毒（HBV）

（四）昆蟲病毒

概況：目前已知的從昆蟲體內分離到的病毒有1671種(1990)，其中80％來自鱗翅目昆蟲。

寄生：主要寄生在昆蟲的真皮、脂肪組織、血細胞、腸道細胞中，有的在宿主的細胞核中，有的在宿主的細胞質里，大量增殖導致宿主組織破壞、死亡。

多數昆蟲病毒可在宿主細胞內形成光鏡下呈多角形的包涵體，稱為多角體。內包裹著數目不等的病毒粒。

分類：根據是否形成多角體和多角體的形態及形成部位，把昆蟲病毒分為3類：

核型多角體病毒：一類在昆蟲細胞核內增殖的、具有蛋白質包涵體的桿狀病毒，數量最多；

質型多角體病毒：一類在昆蟲細胞質內增殖的、可形成蛋白質包涵體的球狀病毒；

顆粒體病毒：具有蛋白質包涵體，每個包涵體內僅含一個病毒粒。

第二節 亞病毒

亞病毒：凡是只含有核酸或蛋白質一種成分的分子病原體。

亞病毒種類：類病毒、擬病毒、朊病毒。

一、類病毒

類病毒：只含RNA成分。目前只在植物體中發現。

1970年代馬鈴薯紡錘形塊莖病（PSTD）中發現。

典型的類病毒是PSTD類病毒（PSTV）。 p77圖3-14

二、擬病毒

擬病毒：指一類包裹在真病毒粒中的有缺陷的類病毒

又叫類類病毒或病毒衛星。

個體極其微小，一般僅由裸露的RNA或DNA所組成。

u 被擬病毒「寄生」的真病毒稱輔助病毒，擬病毒就成了它的衛星。擬病毒的複製必須依賴輔助病毒的協助。

u 目前共發現四種，三種在植物中，一種在動物中發現，即丁型肝炎病毒(HDV)。HDV含ssRNA，它的「宿主」即輔助病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。

三、朊病毒

? 與類病毒和擬病毒不同，朊病毒不含RNA（或核酸），只含傳染性蛋白質分子。

? 損傷中樞神經。比如羊瘙癢病、瘋牛病、克-雅氏病（人類一種老年性痴呆病）都是由朊病毒引起的。

? 借食物入侵。

? 朊病毒的特點：p78

1997年，美國科學家 S.Prusiner「朊病毒的發現」獲得諾貝爾獎。

第二節 病毒與實踐

一、噬菌體與發酵工業

噬菌體：原核生物的病毒，通常指噬細菌體和噬放線菌體。

噬菌體來源：

① 生產菌本身攜帶噬菌體(此時菌種需分離純化)；

② 生產環境存在噬菌體；

③ 相近類型的噬菌體發生變異使其對產生菌敏感而感染。

感染噬菌體後的表現：

① 發酵周期明顯延長；

② 碳源消耗緩慢；

③ 發酵液變清；

④ 在短時間內菌體大量自溶，發酵產物形成緩慢或根本不形成；

⑤ 噬菌體檢測會發現大量噬菌斑；

⑥ 電鏡可看到噬菌體。

感染噬菌體的後果： ① 減產； ② 倒罐； ③ 停產。

感染噬菌體後的處理：

① 發酵液用高壓蒸汽滅菌後放掉，嚴防發酵液任意流失；

② 全部停產，對環境進行全面清洗和消毒；

③ 更換生產菌種，不斷篩選抗噬菌體的菌種。

預防措施：

發酵工業防止噬菌體污染的原則是防重於治。

① 決不使用可疑菌種，選育抗噬菌體突變菌株(必要時添加噬菌體的抑製劑）；

② 嚴格環境衛生，設備定時拆洗，菌種培養室和無菌操作室定期消毒以保持無菌狀態；

③ 活菌液嚴禁排放；

④ 通氣、加料嚴控。保證無菌空氣凈化系統嚴密有效，發酵過程的取樣要嚴密等；

⑤ 嚴防種子攜帶噬菌體進入發酵罐（種子液要進行嚴格的噬檢）；

⑥ 設備滅菌，徹底消除設備死角及滲漏、排除隱患；

⑦ 嚴格執行制度。

二、昆蟲病毒用於生物防治

三、病毒在基因工程中的應用

在基因工程中， 除原核生物的質粒外，病毒是最好的載體。 包括噬菌體、動物病毒、植物病毒、昆蟲病毒。

? 在原核生物基因工程中，常用的載體是λ-噬菌體;

《基因工程》內容，課後閱讀。