你知道在生物學界，「求合體」有多難嗎！（下）

上回說到，有一群科學家為了實現「合體」的夙願，發明了一種叫做「胚胎幹細胞囊胚注射」的技術。這種技術可以隨心所欲地製造出多種動物的「嵌合體」，卻謎一般地無法用在包括人在內的靈長類身上。更悲催的是，就在嵌合體領域的研究者深感困惑之際，半路上還殺出一個叫做「克隆」的新技術，短短几年就搶盡風頭，幾乎一舉宣告了「合體」之路的終結。

克隆技術盛極一時，綿羊「多莉」的大名一度無人不知。但歷史是如此驚人地相似，克隆技術幾乎精確重複了嵌合體技術走過的崢嶸歲月——它一路繁榮，卻在靈長類的克隆上卻走得無比命途多舛^[1]。

從2007年起，作為長江後浪的誘導多能幹細胞（iPSC）技術強勢崛起，輪到克隆技術由盛轉衰，利用克隆技術編輯靈長類基因的想法也隨之變成了鏡花水月。也正是這時候，科學界終於決定重新審視靈長類嵌合體技術的可能性，嵌合體技術開始了它的涅槃重生。

而邁出這關鍵一步的人，正是研究靈長類胚胎幹細胞的泰斗級人物，美籍哈薩克裔科學家沙烏科萊特·米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）。

沙烏科萊特·米塔利波夫。圖片來源：wikipedia.org

如何才能獲得靈長類的嵌合體？在無數幹細胞學家的心中，這個難題彷彿是一片永遠揮之不去的陰霾。無數前輩前赴後繼卻無功而返，到21世紀初，一般人已不敢去冒險涉足這個領域。

但米塔利波夫不是一般人。

既然直接注射靈長類胚胎幹細胞不能獲得嵌合體，米塔利波夫的團隊嘗試回歸原始：直接將一隻獼猴囊胚的內細胞團直接移植到另一隻的囊胚腔中，這也是歷史上第一隻嵌合體小鼠的製作方法。

萬萬沒想到，這兩個內細胞團卻並未融合到一起，而是分別形成了獨立的獼猴胚胎，使代孕母猴懷上了雙胞胎^[2]。

「合體」再次失敗。

要是一般人，做到這份上也該放棄了。但米塔利波夫團隊一不做二不休，決心再搏一把。憑藉多年的胚胎操作經驗，他們設計了一種極具創意的方法——把3個還處於四細胞期的獼猴胚胎直接黏在一起。

終於，他們成功了，幾天後，三個獼猴胚胎如願以償地癒合到了一起。利用直接黏合胚胎這種聽起來簡單粗暴的方法，米塔利波夫的團隊在人類歷史上第一次實現了靈長類的「合體」^[2]。

米塔利波夫為了探索靈長類嵌合體所設計的三個實驗。圖片來源：參考資料[2]總結教訓：「合體」失敗是因為胚胎幹細胞不夠「幼稚」

米塔利波夫還在同一篇論文中推斷了前人不能獲取嵌合體猴的原因——體外培養的胚胎幹細胞的「狀態」有問題^[2]。

研究者意識到，體外培養的胚胎幹細胞其實存在兩種不同的「狀態」（State）： 「幼稚態」（Na?ve State）和 「啟動態」（Primed State）^[3]。

打個比方，我們的身體就像是一個社會，其中每一個體細胞都被訓練得高度「專業」以適應自己的功能。而胚胎幹細胞就像是還沒有接受過任何專業訓練的學生， 具有從事各種職業的潛能。

其中，「幼稚態」的胚胎幹細胞好比是小學生，還沒有任何專業傾向，因此成長為任何職業都沒問題；而「啟動態」的胚胎幹細胞就好比是大學生，雖然也叫學生，但實際上已經有了專業分化，儘管還存在跨專業求職的可能性，但是基本都會在本專業範圍內找工作。

大部分哺乳動物的發育機制比較靈活，它們的「大學生」想要換專業雖然不容易，但也不是不可能；而靈長類的發育機制則非常死板，對於「轉專業」的容忍度極低，甚至還會故意排斥「計劃外」的大學生。

圖中是一些體外培養的小鼠胚胎幹細胞。黑色箭頭所指的是「幼稚態」胚胎幹細胞的團塊，紅色箭頭所指為「啟動態」胚胎幹細胞。這兩種不同狀態的胚胎幹細胞截然不同的形態特徵。圖片來源：參考資料[3]

問題的關鍵，正在於湯姆森等科學家所用培養靈長類胚胎幹細胞的培養液，恰好會把它們誘導成「高年級的大學生」——還去了不太好找工作的專業。

米塔利波夫這一假說可謂一舉重燃了全世界製造靈長類嵌合體的熱情。瞬息之間，嵌合體研究原地滿血復活了。

米塔利波夫的一語道破，令各路科學家誓要不擇手段地把胚胎幹細胞都變成像名偵探柯南一樣的萬年小學生。短短兩年，各種號稱可以將靈長類胚胎幹細胞轉化成「幼稚態」的培養體系如雨後春筍般迸發出來。

其中，有五大體系最為引人注目：幹細胞學界一代宗師魯道夫·詹尼士（Rudolf Jaenisch）主導開發的詹尼士體系 ^[4]；北京大學鄧宏魁團隊所開發的鄧宏魁體系 ^[5]；以色列科學家雅各布·翰拿（Jacob H. Hanna）等開發的翰拿體系^[6]；美國「命運療法公司」（Fate Therapeutics, Inc.）開發的弗林體系^[7]；美國生物化學家漢內萊·羅霍勒-貝克（Hannele Ruohola-Baker）等開發的貝克體系^[8]。它們堪稱靈長類胚胎幹細胞學界的「五嶽劍派」。

武林高手用拳腳論高下，而科學家則要用實驗來分伯仲。最終決定勝負的必須是嵌合體實驗，但是在數年時間內他們沒有一家敢輕易嘗試去直接製造嵌合體猴。

打響試探第一槍的是鄧宏魁。

2014年，鄧宏魁團隊將他們培養的「幼稚態」獼猴誘導多能幹細胞注射到了小鼠的囊胚當中。結果鄧宏魁的團隊在一部分發育到10.5天的小鼠胚胎當中找到了極其微量的嵌合痕迹。但再怎麼微量，這也是人類歷史上首次通過囊胚注射的方法獲得帶有靈長類細胞的嵌合體。此後，他很快又和中國最大的非人靈長類實驗平台中科院昆明動物研究所宣布合作。

全力開展靈長類嵌合體的攻關任務，眼看著將要被鄧宏魁拔得頭籌。

然而不久之後，事情卻有了出人意料的發展。

2015年7月，當鄧宏魁的研究還沒有傳出任何消息的時候，中科院北京動物研究所的副所長周琪和昆明靈長類轉化醫學研究中心的季維智、李天晴突然宣布，他們已經率先合作完成了食蟹猴嵌合體的構建工作。

率先利用「幼稚態」胚胎幹細胞獲得靈長類嵌合體的三位科學家。自左向右：周琪，季維智，李天晴，其中李天晴的團隊是大部分研究工作的直接承擔者。圖片來源：北京動物研究所與昆明靈長類轉化醫學研究中心官網

萬眾期待的靈長類嵌合體被製造出來了，用的體系卻不是鄧宏魁的——在這新一輪的「華山論劍」中，原本並不算最出眾的翰拿體系[6]逆襲了。李天晴等科學家以翰拿體系為基礎並加以改進，設計出了一種新的複合體系[9]，利用被他們稱為「類幼稚態」（Na?ve like State）的胚胎幹細胞，完成了這項壯舉。

李天晴等人體外培養的食蟹猴「類幼稚態」胚胎幹細胞。右圖為左圖中一個單獨細胞團塊（白色方框）的放大。圖片來源：參考資料[9]

李天晴等人在製作食蟹猴嵌合體的方法上也進行了一些革新。它們摒棄了傳統的囊胚注射，而是採用相對「非主流」的桑椹胚注射法。他們成功製作了14枚食蟹猴嵌合體囊胚，並很小心地把這些囊胚移植到5隻代孕母猴體內。由於經過人工操作的食蟹猴胚胎存活率較低，所以他們給每隻母猴都移植了兩到三枚胚胎。

5隻代孕母猴中，有4隻都未能成功受孕，而剩下的一隻，則一下子懷上了雙胞胎。這可不是什麼好事：食蟹猴子宮較小，懷上雙胞胎的話很有可能會導致兩個胎兒一齊流產，而食蟹猴又有吞噬流產幼崽的習性。經過反覆權衡後，李天晴的團隊決定在懷孕到100天的時候（食蟹猴正常懷孕周期大約是160天），提前將食蟹猴胎兒剖腹取出。

李天晴等科學家製作食蟹猴嵌合體的流程。圖片來源：參考資料[9]

經檢測，這兩隻食蟹猴胎兒都是嵌合體，而且它們的嵌合比率都達到了較高水平，在不同的器官中，嵌合比率普遍可以達到1%到18%，有理由認為，如果讓這兩隻嵌合體胎兒成功出生的話，它們已經可以滿足相當多實驗的需求。

儘管沒有得到活的嵌合體猴個體略讓人遺憾，但是他們的工作終於打破了靈長類「合體」的最後一道禁制，帶來了新時代的曙光。

既不因畏懼後浪推前浪而深藏不露，也不因盲目崇古而固步自封，一代代人薪火相傳，正是科學有別於其它思想的關鍵所在。加德納，馬丁爵士，湯姆森，米塔利波夫，翰拿，李天晴……無數科學家的繼往開來，終得以將「合體」這樣的天方夜譚最終變為現實，正是最典型的一例明證。

（編輯：Calo）

1. 鬼谷藏龍，克隆人離我們還有多遠？
2. Tachibana, M., Sparman, M., Ramsey, C., Ma, H., Lee, H. S., Penedo, M. C. T., & Mitalipov, S. (2012). Generation of chimeric rhesus monkeys. Cell, 148(1), 285-295.
3. Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., ... & Smith, A. (2008). The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 453(7194), 519-523.
4. Theunissen, T. W., Powell, B. E., Wang, H., Mitalipova, M., Faddah, D. A., Reddy, J., ... & Jaenisch, R. (2014). Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell, 15(4), 471-487.
5. Fang, R., Liu, K., Zhao, Y., Li, H., Zhu, D., Du, Y., ... & Deng, H. (2014). Generation of naive induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell stem cell, 15(4), 488-496.
6. Gafni, O., Weinberger, L., Mansour, A. A., Manor, Y. S., Chomsky, E., Ben-Yosef, D., ... & Hanna, J. H. (2013). Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature, 504(7479), 282-286.
7. Valamehr, B., Robinson, M., Abujarour, R., Rezner, B., Vranceanu, F., Le, T., ... & Flynn, P. (2014). Platform for induction and maintenance of transgene-free hiPSCs resembling ground state pluripotent stem cells. Stem cell reports, 2(3), 366-381.
8. Ware, C. B., Nelson, A. M., Mecham, B., Hesson, J., Zhou, W., Jonlin, E. C., ... & Ruohola-Baker, H. (2014). Derivation of naive human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(12), 4484-4489.
9. Chen, Y., Niu, Y., Li, Y., Ai, Z., Kang, Y., Shi, H., ... & Li, T. (2015). Generation of Cynomolgus Monkey Chimeric Fetuses using Embryonic Stem Cells. Cell stem cell, 17(1), 116-124.

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