姿勢 | CRISPR研究中的幕後英雄們

06-15

CRISPR-Cas9 的基因組編輯技術給整個學術界和工業界帶來革命性的變化，隨之而來的還有CRISPR專利之爭。然而，我們知道一項科學技術的發展不是一蹴而就的，往往要經歷了前後多輩及多個團隊的努力才能有所突破。

科學家報告說，CRISPR技術可實現精確，高效的在活的真核細胞中進行基因組編輯，從那時開始，這項技術像風暴一般席捲科學界，有數以千計的實驗室在用它進行生物醫藥或者農業方面的研究。而這所有的一切都開始於一項微生物的研究……

古微生物實驗的驚奇發現

故事發生在西班牙的科斯塔布蘭卡，Francisco Mojica在當地的一個實驗室研究古微生物。他發現培養基中的鹽濃度影響著限制酶切斷該微生物基因組的方式，他決定試著改變這些片段的特徵。在他檢查的第一個DNA片段中，發現了一個令人驚奇的結構，多份近乎完美的迴文結構，重複著30個鹼基序列，由大約36個鹼基間隔開。之前沒有任何微生物是這樣的。一開始這個現象被稱為短規則間隔重複（SSR），後來在Mojica的建議下，它被叫做Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats（CRISPR）。

但依照Mojica的假說，CRISPR能夠參與基因調控、複製子分區、DNA修復以及其他許多功能。但現在大多數的假設都鮮有證據，還有一些被證明是錯誤的。

荷蘭科學家與編程CRISPR

John van der Oost是一位荷蘭科學家。他和他的同事們將大腸桿菌CRISPR系統插入另一株大腸桿菌中。這讓他們通過得到了一個5個Cas蛋白的複合物，稱為Cascade。通過單獨的敲除每一個組件，他們發現Cascade需要切割很長的前體DNA，要從CRISPR基因轉錄到61個核苷酸長度的CRISPR RNA （crRNAs）。他們在克隆和測序了一組與Cascade共純化的crRNAs，結果發現所有的序列都開始於最後8對鹼基的重複序列，後面跟著完整的鹼基間隔和下個重複區域，這一發現證實了重複的迴文序列會導致crRNA二級結構的形成。

為了證明crRNA序列對CRISPR的影響，他們準備創造第一個人造CRISPR陣列，將CRISPR編入λ噬菌體的4個基本基因。正如預想的一樣，搭載著CRISPR序列的菌株對λ噬菌體產生了抵抗，這也是第一次直接編程CRISPR。這個結果也暗示了CRISPR的作用目標並不在RNA，而是DNA。

CRISPR「瞄準」DNA的芝加哥學者Marraffini

芝加哥大學學者Luciano Marraffini也確信CRISPR無法通過RNA干擾發揮作用，因為這個機制實在是效率太低，無法剋制噬菌體傳染時候的爆髮式增長。所以他推測，CRISPR肯定是像限制性內切酶那樣切割DNA。

Marraffini通過分子生物學的方法，用CRISPR系統修改目標質粒中的內斯基因，在其序列中插入一個自我剪接的內含子。如果CRISPR的目標是mRNA，這項改變就不會產生影響，因為內含子序列會被剪切掉；如果CRISPR的目標是DNA的話，就會產生干擾，因為鹼基間隔會不再匹配。結果很清楚：CRISPR「瞄準」的是DNA。Marraffini認為，CRISPR基本上是一個可編程的限制性內切酶，他的論文是第一個明確地預測CRISPR可能在異源系統中被用於基因組編輯。

cRNA引導Cas9生成雙鏈斷裂的DNA

CRISPR一般來說是非常高效的，以至於根本無法觀察到它入侵和破壞DNA的作用機制。Sylvain Moineau和他的同事們觀察嗜熱鏈球菌的質粒干擾，發現質粒的切割取決於Cas9核酸。當它們測序線性質粒，一個單一的精確末端切割的PAM序列。經過他們進一步的分析，發現在病毒DNA中切斷的位置也是相對於PAM序列的地方。他們研究明確表明了，活性Cas9核酸酶能在特定的編碼序列位置上精確地切割DNA。

在哺乳動物中的基因編輯

在20世紀80年代末，科學家們就發明了一種在活體細胞中改變哺乳動物基因的方法，包括在小鼠胚胎幹細胞中的特定位置插入DNA，但這些方法都需要對目標進行選擇和篩選，效率低下。

因為Marraffini和Sontheimer的論文明確了CRISPR是一個可編程的限制性內切酶，研究人員已經掌握了CRISPR切割特定基因位點的方法。接下來最大的問題就是，如何讓CRISPR在哺乳動物的細胞中工作。相比微生物，哺乳動物的基因組是其1000倍，且在細胞核中的一個染色質結構中。因此在2012年9月，專家們對於編輯人類基因組還持著懷疑的態度。

張鋒發現在哺乳動物細胞中，雖然缺少微生物中的核糖核酸酶III，也仍然可以處理crRNA。在2012年中，他提出一個穩健的三足鼎立結構，Cas9、tracrRNA和CRISPR陣列。針對在人類和小鼠基因組16個地點，可以高效準確的變異基因刪除非同源末端連接，並通過同源重組修復模板插入新的序列。此外，多個基因可同時通過CRISPR陣列來編輯。在2013年1月3號的《Science》上出版了張鋒第一篇哺乳動物基因組編輯的報告，它會成為該領域被引用最多的論文。

從2013年初開始，谷歌中「CRISPR」搜索量就一路飆升。在一年之內，研究人員報告了許多生物，包括酵母，線蟲，果蠅，斑馬魚，小鼠和猴子使用CRISPR為基礎進行基因組編輯。在人類治療和農業中對其應用前景也開始關注，而且該技術甚至可用於「生產設計」嬰兒。

這個故事給我們的啟示是，，醫學上的突破往往是從完全不可預測的起源湧現。 CRISPR的早期英雄不是在尋求修改人類基因組，甚至是研究人類疾病，而只是因為他們旺盛的好奇心。

參考文獻：The Heroes of CRISPR

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