BRCA基因檢測不得不說的那些事

基於NGS平台的BRCA檢測對醫生朋友距離很近又似乎很遠：臨床實踐中檢測訴求很明確，但檢測過程像個黑匣子玄之又玄，讓不少人對檢測望而生畏。BRCA基因本身有什麼特點？對應於檢測有哪些合適的方法？流程有哪些關鍵步驟？哪些樣本可用於檢測？遺傳解讀需要達到什麼水平才能保障結果的準確性？為什麼體細胞突變檢測目前那麼少見？今天就來深入八一八，解答BRCA檢測中常見的疑惑。

1. BRCA1和BRCA2基因介紹

BRCA1和BRCA2是最早發現的直接與遺傳性乳腺癌有關的兩個基因。作為抑癌基因，兩者在調節細胞複製、DNA損傷修復、細胞的正常生長方面起著重要作用。BRCA1/2基因序列很長。具體來說，BRCA1長81.2kb，由22個編碼外顯子組成，轉錄形成5.7kb的mRNA。BRCA2長84.2kb，由26個編碼外顯子組成，mRNA長為11kb。

根據BIC資料庫（Breast Cancer Information Core, http://research.nhgri.nih.gov/bic/），BRCA1和BRCA2基因目前已報道的變異類型包括無義突變、移碼突變、非移碼插入、非移碼缺失、錯義突變、同義突變、剪接位點突變，以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000個變異位點，而且這些突變分散遍佈於各個外顯子，沒有證據表明存在突變熱點區域，只存在少數幾個相對高頻的變異位點。若用傳統的Sanger測序、qPCR方法或MLPA等對BRCA1/2整個基因進行檢測，都不能一次性檢測BRCA1和BRCA2基因的所有變異類型，且需要耗費大量的時間並且價格不菲。相比之下，高通量測序技術-二代測序技術以其更為高效快速且能一次性對BRCA1和BRCA2基因所有外顯子及鄰近上下游區域內的變異同時進行檢測，以更高性價比的優勢脫穎而出，成為BRCA1/2基因檢測市場的主力軍。

2. BRCA胚系突變檢測流程

利用二代測序技術開展BRCA突變篩查檢測，其流程複雜且專業性強（如下圖1），對工作人員專業技術能力和檢測流程的技術操作、質量控制的要求高。

圖1. BRCA胚系突變篩查檢測流程

在實驗室人員能力方面，專業的技術人員是檢測結果準確的重要保障。需要對不同方向的技術人員分別進行專業的臨床基因擴增檢驗能力、生物信息分析能力和遺傳解讀能力等培訓，技術人員獲得相應的上崗證和資格證書後方可進行相關操作執行。

在檢測流程方面，實驗室收到檢測樣本後，採用標準流程提取基因組DNA。通常有2種方法構建測序文庫：一種是利用超聲波儀將基因組DNA打斷，進行DNA建庫。再利用定製探針與標記好的患者DNA文庫雜交，雜交結束後進行洗滌和洗脫反應，再經PCR擴增構成測序文庫；另一種是設計BRCA基因特異的引物，用多重PCR的方法把BRCA基因上感興趣的區域擴增，然後進行加接頭、純化等反應，構建測序文庫。測序文庫質控合格後利用高通量測序儀讀出原始測序數據。測序完成後，數據分析流程見下圖2。

圖2. 信息分析流程

首先對原始數據進行測序質量評估，去除低質量和接頭污染的「噪音」數據，然後將得到的無雜訊的數據與參考基因組序列進行比對。基於比對結果，進行變異分析。最後，對檢測到的變異參考若干資料庫及查閱文獻進行臨床意義解讀。

整個檢測流程每一個環節都需要設置相應的技術操作規範，嚴格遵照技術操作程序執行，並開展室內質量控制，參加國家衛生計生委臨床檢驗中心組織的室間質量評價。國家衛生部臨床檢驗中心於2015年10月首次組織開展了全國腫瘤診斷與治療高通量測序檢測室間質量評價測評活動。此次測評活動分胚系突變和體細胞突變兩個部分，胚系突變的合格率為84.1%，100%正確的實驗室77.3%；體細胞突變的合格率僅51.2%，全對的實驗室僅佔16.7%。對於現今活躍的腫瘤診斷與治療高通量測序檢測市場，這無疑也敲響了警鐘，呼籲整個市場的規範化標準化。

此外，由於整個檢測流程繁瑣複雜，操作步驟繁多，為保障檢測結果的有效性和準確性，有臨床意義的位點（致病和疑似致病的突變）都必須經過區別於NGS平台的另一平台（如，Sanger和/或qPCR等）進行驗證。在經歷了二十幾步嚴格質量把控環節後，一份完整由專業解讀人員撰寫的BRCA基因檢測報告才會到達醫生手中，為患者提供準確的基因參考信息。

介紹完BRCA基因檢測的整體流程，下面我們著重針對醫生朋友需要接觸到的兩個環節，樣品收集和報告解讀進行介紹。

3. 樣品收集

BRCA基因檢測的過程中，最基本的要素是樣本的可靠性。只有從最初保證樣本質量以及準確的臨床資料，才能獲得最為精準的基因檢測結果。下面詳述BRCA基因檢測採樣時的注意事項。

首先，醫生需要與患者充分溝通，在患者充分理解基因檢測的價值、必要性並認可基因檢測的情況下，方可進行進一步的填寫表單（包括申請單與知情同意書）以及採樣。申請單必須要包括受檢者姓名、年齡、性別、民族、籍貫、個人疾病史、家族疾病史等，以避免後期樣本混淆的可能，同時對於部分特殊、具有家族史的成員，出現較罕見的基因突變時信息也便於及時反饋給送樣醫生，為患者提供更為嚴格準確的檢測結果以及更為科學的進一步治療方案。知情同意書的意義在於給患者更為詳實的檢測介紹，進一步理解基因檢測的內容與意義，規避可能存在的倫理風險。

其次，採樣流程。過程包括樣本採集與樣本標記。BRCA基因檢測多採用外周血樣本採集，少數會提供唾液、DNA樣品。

對於採集後的樣本，在採集管上貼上樣本唯一條碼，並註明受檢者姓名、年齡等信息；樣本交接單上必須標有受檢者姓名或入庫編號、採樣日期，確保信息與申請單一致，以避免不必要的混淆可能。為保證運輸過程樣品的保護，請選擇專業的物流機構並嚴格按照要求完成。

4. 遺傳報告解讀流程

遺傳報告解讀也具有一套嚴格的流程。原則上均以美國醫學遺傳學與基因組學學院（ACMG）頒布的基因變異解讀和指南為解讀標準，首先利用公共和本地突變資料庫對變異頻率進行過濾。經過對功能預測分析軟體結果、資料庫記錄、文獻研究報道綜合考慮，並結合臨床表型，專業遺傳報告解讀人員會做出數據分析和解讀。遺傳分析解讀最終需要對篩選出來的突變進行判定，按照美國國立衛生院NIH的分類標準，遺傳性腫瘤易感突變分為五類，致病突變、疑似致病突變、意義未明突變、疑似良性突變及良性多態性。解讀報告除了對突變進行健康等級分類外，也會為醫生及患者提供FDA批准上市針對BRCA突變靶向藥物相關的信息（如針對BRCA基因突變的晚期卵巢癌患者治療，FDA批准上市的阿斯利康的奧拉帕利（Olaparib, 商品名 Lynparza）。嚴格的標準化解讀流程以及具有資質的專業遺傳信息解讀人員都是遺傳報告解讀必不可少的部分，解讀人員需要具備遺傳學、醫學或藥學專業背景，並且經過專業的遺傳信息解讀培訓以及實際解讀經驗，才能勝任這一工作。

5. BRCA體細胞突變檢測現況

在乳腺癌、卵巢癌中檢測到的BRCA 1/2 突變，其中20%左右是由於體突變引起。體細胞突變的檢測需要正常組織做對照，常用血細胞做對照（如TCGA 癌症研究）。研究發現，體細胞突變與胚系突變的卵巢癌，乳腺癌病人在生存、預後方面沒有明顯的差異，並且都可以用奧拉帕利進行治療。但是相對於胚系突變，體細胞突變檢測難度大些。檢測的難度和準確性主要受樣本類型、癌症細胞含量以及突變比例（具有BRCA 1/2 體細胞突變的癌細胞占所有癌細胞的比例）等影響。因此，針對BRCA基因體細胞突變的檢測技術還在完善中。

供稿人員：華大基因高爽、李世勇、李紅梅、曾憲一

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