焦磷酸甲基化測序

DNA甲基化是近年來研究的熱點，因為越來越多的證據表明，它參與了胚胎髮育、基因印跡等過程。同時，它在疾病發展中也起著舉足輕重的作用。甲基化狀態的改變被認為是引起癌症的一個重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導致基因組的不穩定（如染色體的不穩定、原癌基因的表達）和抑癌基因的不表達。

DNA的甲基化分析，有很多條路可以選擇，從亞硫酸氫鹽轉化這條主幹道出發，之後可以選擇限制性酶切分析、實時定量PCR、測序和焦磷酸測序等。然而，並非所有方法都能提供單個CpG位點的定量數據。亞硫酸氫鹽處理+測序一度被認為是甲基化分析中的金標準，但如果對5-10個克隆測序，這種方法充其量只是半定量。

焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

通過準確定量單個連續的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序本身能檢測並定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測。由於焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。

同時，新一代測序（NGS）在甲基化研究中也開始嶄露頭角。454（後被羅氏收購）以焦磷酸技術為基礎，開發出了新一代測序平台。之後，Illumina的Solexa測序儀和ABI的SOLiD測序儀陸續推出。這些大規模並行測序平台帶來了不斷提高的通量，同時使測序成本不斷下降，目前正廣泛應用於基因組測序和重測序、轉錄組分析和表觀基因組研究。對於甲基化研究，這些平台帶來了非常靈敏的DNA甲基化圖譜，以單分子解析度覆蓋整個CpG島。

新技術不斷湧現，我們在實際應用中應如何選擇，才能發揮出它們本身的優勢。科學家們也在不斷探索。德國漢諾威醫學院Anna Potapova領導的研究小組對454測序和QIAGEN的焦磷酸測序進行了系統的交叉驗證。在今年1月的《BMC Biotechnology》上，他們發表了他們的研究成果1。

研究人員分析了10個原發性肝癌標本中12個位點的甲基化模式。他們先對基因組DNA開展亞硫酸氫鹽修飾，再利用120對引物對選定的位點進行擴增，之後開展454測序和焦磷酸測序。他們將454測序所獲得的單個CpG位點的甲基化水平與傳統焦磷酸測序的相應值進行了比較。統計分析表明，所有單個CpG位點的甲基化水平都有著極佳的一致性。

作者認為，高通量的454技術實現了整個CpG島的更全面覆蓋，且單分子解析度為甲基化模式的異質性提供了前所未有的信息。它能夠平行研究多個位點。同時，作者也強調，這些優點也伴隨著一些劣勢，比如相當大的一筆投資、試劑昂貴、周轉時間長、數據分析要求高等。這些特點使得454測序更適用於在基因組範圍內目標區域的確定，而對不同樣品在目標區域的CpG位點的定量分析由於樣方數量大，如果每個樣品都採用454技術進行分析，則成本就會過於巨大。

相比之下，QIAGEN的焦磷酸測序更快、更簡單，且便宜得多。它能夠以相同的準確性和解析度帶來同樣高解析度的數據，而費用只有454測序運行的一小部分。如果是針對已確定的目標區域進行甲基化定量分析，那麼傳統的焦磷酸測序不啻為最佳方法。與之相印證的是，目前QIAGEN的焦磷酸測序技術已逐步應用於臨床診斷中，如消化道腫瘤相關的KRAS基因，BRAF基因的突變檢測，肺癌相關的EGFR基因突變的檢測， 以及白血病相關的NRAS基因突變的檢測。

這篇文章中的數據展示了454測序和QIAGEN焦磷酸測序對大部分CpG位點帶來了明顯一致的結果，即使是那些表現出不同甲基化模式或甲基化水平極低的位點。作者強調：「在我們看來，傳統的焦磷酸測序和454測序並非競爭方法，而是互補方法，它們在DNA甲基化分析領域執行了不同的功能。」

美國亞特蘭大疾控中心的研究人員也曾利用焦磷酸測序技術，來定量PRFI啟動子的甲基化水平2。PRFI基因在免疫監視中發揮重要作用，其啟動子區域CpG位點的差異甲基化導致了PRFI的差異表達。研究人員以焦磷酸測序為基礎，開發出一種方法，來定量32個CpG位點的甲基化水平。他們認為，這種位點特異的定量方法非常適合免疫功能紊亂等疾病的大規模分子流行病學研究。

QIAGEN 的PyroMark平台用於特定區域CpG位點分析，除了提供每個位點的甲基化程序信息之外，還很好地解決了甲基化檢測中很重要的一個環節——亞硫酸氫鹽轉化完整性質控。由於在人類與動物中，模板序列中後面不是鳥嘌呤G的胞嘧啶C不會被甲基化，因此通過亞硫酸氫鹽的處理和PCR 後轉化成胸腺嘧啶T。如果所有模板的這些位置都顯示出胸腺嘧啶T，而不是胞嘧啶C，即可確認實現了完全的亞硫酸氫鹽轉化，這些結果均可在測序結果中一一體現（圖1）。

圖1. 多個相鄰的CpG 位點的分析。在單次焦磷酸測序運行中定量9個獨立的CpG 位點的甲基化（以灰色突出顯示）。分析序列背景中位點特異的信息代表了廣泛的序列甲基化模式。注意含有胞嘧啶的內置質量控制位點（以暗黃色突出顯示）轉化成胸腺嘧啶，說明被處理DNA 的亞硫酸氫鹽轉化充分。

除了甲基化分析，QIAGEN焦磷酸測序的優勢還讓它成為高通量和單個位點分析的理想選擇，包括基因分型和等位基因拷貝數定量，微生物鑒定和耐藥性分型，以及基因組測序研究的數據驗證。

QIAGEN目前提供了三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMark Q24可對最多24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應用更適合在PyroMark Q96 ID 上進行。考慮到處理成百上千個樣品需要大量試劑，而運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。故PyroMark Q96 MD 裝有一台高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準確測序。

除了焦磷酸測序儀，QIAGEN還提供了多種產品，覆蓋甲基化研究的每個流程，包括樣本的採集和穩定，基因組DNA 純化，亞硫酸氫鹽轉化及CpG位點的甲基化檢測，針對人類基因組的所有CpG位，QIAGEN 還提供經生物信息學驗證的Assay，用戶可直接使用而無需進行實驗設計。詳細請看《Qiagen為您奉上完整的甲基化研究方案》和登陸www.geneglobe.com查找相關的Assay。

參考文獻1.Potapova, A., et al. (2011) Systematic cross-validation of 454 sequencing and pyrosequencing for the exact quantification of DNA methylation patterns with single CpG resolution. BMC Biotechnol. 11: 6.2.Narasimhan, S., et al. (2009) Determination of quantitative and site-specific DNA methylation of perforin by pyrosequencing. BMC Res Notes. Jun 12;2:104.

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