【黃軍就點評】科學狂人Nature發表編輯人類胚胎成果丨BioArt特別關注

BioArt按：科學狂人Shoukhrat Mitalipov曾被美國科學院、藝術科學院、醫學科學院三院院士Douglas C. Wallace（國際線粒體醫學領域的頂尖學者）譽為「絕無僅有的天才」（exceptionally talented person），他是一位在生物倫理學界飽受爭議的科學家。Mitalipov博士此前因為置換了一對孿生雄猴的線粒體而名噪一時，此後在此基礎上進一步獲得了置換線粒體的人類卵細胞而進一步走進公眾視野，2013年更是因為通過核移植技術首次獲得了人類胚胎幹細胞而引發學術界和大眾的熱議，如今Mitalipov又成為了美國第一位利用基因編輯技術編輯人類胚胎進行致病基因修正的科學家，再次進入各大新聞媒體的頭條。8月2日，Nature雜誌以長文形式（Article）發表了俄勒岡國家靈長類動物研究中心Shoukhrat Mitalipov研究組聯合韓國基礎科學研究所國立首爾大學Jin-Soo Kim研究組、加州Salk生物醫學研究所Juan carlos izpisua Belmonte研究組以及中國華大基因的研究人員等合作完成的題為「Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos」的重要研究論文，利用CRISPR-Cas9 基因組編輯技術修正了未被植入子宮前的人類胚胎中一種和遺傳性心臟疾病有關的變異，並進一步證實編輯人類生殖細胞系（卵子、精子或早期胚胎）的DNA是安全有效的。然而，該技術在進入臨床應用前仍然面臨著諸多亟待解決的問題，後續需要更多的相關研究進一步評估該技術的可靠性、安全性以及面臨的倫理問題。事實上早在2015年來自中山大學的黃軍就副教授就利用基因編輯技術改造了人類胚胎，黃軍就博士還因此成為了Nature2015年度十大科學人物。值得一提的是，Nature對這項研究成果還配發了評論文章「At the heart of gene edits in human embryos」，對上述研究給予了很高的評價並且對該技術應用於臨床提出了一些亟待解決的問題。鑒於該成果可能會產生一系列重要社會反應，BioArt特別邀請了中山大學黃軍就教授對該項成果進行了詳細的點評，以饗讀者！

論文解讀：

撰文丨丁廣進

評論丨黃軍就（中山大學生命科學學院）

7月26日，《MIT技術評論》的一篇題為「First Human Embryos Edited in U.S.」的報道頓時引爆了生物圈，該報道瞬間引發國內外各大媒體的廣泛轉載，一時間編輯人類胚胎修正致病基因成為熱門話題。

由於當時的新聞報並沒有具體的相關論文信息，一時間也無法獲知具體的實驗結果，甚至還有人對這項工作是否能發表出來表示懷疑。然而，相關論文在一周後就在Nature上發表出來了，實驗結果也是讓人十分興奮的。這篇論文是由多家研究單位合作完成的，來自中國的華大基因也有三位科學家（華大基因研究院院長徐迅，Jianhui Gong，顧穎）參與了該項工作，值得關注的是該文有五位共同通訊作者，而此前一般認為Nature雜誌限定通訊作者最多不超過3人。

利用基因編輯技術對人類胚胎進行編輯早就不是什麼新聞了，事實上早在2015年來自中山大學的黃軍就團隊就曾在Protein & Cell雜誌上發表文章率先利用CRISPR–Cas9基因編輯技術對人三原核（3PN）受精卵中的地中海貧血症相關基因HBB（β-globin gene，編碼紅細胞β-珠蛋白）進行了改造（下圖，目前該文在谷歌學術上被引次數超過400次）【4】。

去年 4月，來自廣州醫科大學附屬第三醫院的范勇團隊在Journal of Assisted Reproduction and Genetics雜誌上發表文章，報道了他們使用CRISPR/Cas9技術對人三原核（3PN）受精卵中的細胞膜蛋白基因CCR5基因（HIV病毒入侵T細胞的主要受體之一）進行編輯獲得了能有效免疫艾滋病病毒的 CCR5Δ32缺陷基因【5】。

今年3月，來自廣州醫科大學附屬第三醫院劉見橋團隊與北京蛋白質組研究中心的唐立春博士等合作在Molecular Genetics and Genomics雜誌上發表文章，首次將CRISPR/Cas9技術運用於人類二倍體胚胎，對突變的HBB和D6PD（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，該基因純合突變會導致蠶豆症）基因進行了修復【6】。

由於上述三項來自中國的成果都存在一定的鑲嵌胚胎和基因編輯脫靶效應，所以上述成果也引發了一些爭議和對將來可能應用於臨床中安全性的質疑。

在這項研究中，研究人員首次運用CRISPR–Cas9基因編輯技術在人類早期胚胎中修正了一種與心肌肥大發生相關的突變基因MYBPC3，並且評估了該項技術的有效性和安全性。這項技術未來如果運用於臨床治療，那麼許多遺傳病患者將有可能通過該技術阻止將有害變異的基因傳遞給後代。

肥厚型心肌病 （HCM, Hypertrophic cardiomyopathy）是一種表現為心室肌肥厚的心肌病，主要特別是室間隔的非對稱性肥厚（下圖）。肥厚型心肌病有很高的猝死風險，是運動性猝死的原因之一【7】。該疾病是一種常染色體顯性遺傳病，有一半以上的疾病呈現家族聚集性，目前該病的全球發病率約為1/500【8】。

正常和心肌肥厚型心臟。圖片來源：Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2)

在眾多導致肥厚型心肌病（HCM）發生的突變基因中，MYBPC3（心肌肌球蛋白結合蛋白 C3）是最為常見的致病基因【9】，其突變所致HCM 佔到 20%~25%【10】，在家族性HCM中佔到大約40%。目前針對HCM的治療方案可以緩解癥狀但是不能從根本上解決遺傳突變的因素。

隨著近年來以CRISPR–Cas9為代表的基因編輯技術的廣泛應用，通過基因編輯手段修正人類胚胎中的突變致病基因慢慢地變得容易可行。

在這項研究中，研究人員使用婦女自願捐獻的卵和患有肥厚型心肌病的患者（攜帶單拷貝MYBPC3突變基因）提供的精子進行研究。CRISPR–Cas9技術主要由韓國基礎科學研究所的Jin-Soo Kim課題組提供。此前的研究往往都是在實施體外受精之後的受精卵中注射CRISPR–Cas9系統，但是這種技術面臨的最大問題是會產生一些嵌合體胚胎，得到的是混合有基因編輯修復過和沒有修復過的胚胎，這也會帶來一些列衍生的問題。而這項研究中，研究人員在向卵細胞中注射精子的同時也將CRISPR–Cas9一併注射進入，最終的結果是這個方法具有很高的準確性，嵌合體胚胎並沒有產生（下圖）。

圖片引自Nature配發的評論文章「At the heart of gene edits in human embryos」

實驗結果表明，在實驗組中的58個受試胚胎中，有42個胚胎沒有攜帶肥厚型心肌病致病基因突變，佔比74.2%（對照組為47.4%，因為理論上如果不進行基因編輯處理，也有一半的精子是正常的，所以對照組的比理論上為50%），換句話說就是將產生完全正常的胚胎的比例從50%提高到了74.2%。其中，非常有意思的一個發現是，在這42個正常胚胎中，僅有一個胚胎最終獲得野生型的致病基因是利用基因編輯技術以引入的模板進行修正的，也就是說野生型MYBPC3基因的母源拷貝才是大多數胚胎中進行基因修正的模板。而餘下的27.6%的胚胎引入了一些非預期的插入或缺失突。

圖左為基因編輯前的受精卵，右圖是受精卵進行基因編輯後正常發育至8細胞期

在未來的臨床應用當中，基因編輯過程中的脫靶問題一直以來都是人們最關心的問題之一，因為這直接關聯了該技術的安全性。在這項研究中，研究人員為了降低基因編輯脫靶帶來的風險，他們採用注射重組好的Cas9蛋白而不是質粒來完成基因編輯，這種方法減少了酶暴露的時間，增強了基因編輯的特異性。為了進一步驗證是有出現基因脫靶位點，研究人員通過深度測序手段對基因組進行了分析，結果並沒有檢測到脫靶位點。

此外，該論文的作者還在論文討論部分提到，未來還需要更多相關的研究去進一步解決對純合突變的致病基因進行基因編輯修正的問題，這當然也十分具有挑戰性。

總的來說，實驗結果表明這種治療方法是有效的，且CRISPR-Cas9靶向十分精確，這讓人們對該方案的安全性有了更多信心。此外，該實驗中並未出現脫靶變異。這些結果表明這種治療方法或許可以和胚胎植入前遺傳診斷一起被用於修正人類胚胎中的遺傳性變異。

論文第一作者，Hong Ma博士

據Shoukhrat Mitalipov實驗室官網信息顯示，論文第一作者Hong Ma早年是在西安醫科大學（現西安交通大學醫學部）獲得的醫學博士學位（MD），後來在日本京都大學獲得分子生物學博士學位。Hong Ma博士後來在美國俄亥俄州立大學牙科學院工作了13之久，2008年加入Mitalipov實驗室成為一名Staff Scientist負責該實驗室的管理。

專家點評：

黃軍就（中山大學生命科學學院）

Comments（原標題《胚胎基因編輯風雲再起》）：人類基因總數大約在2-2.5萬個之間，而已知的單基因變異就能導致的發育異常或疾病有7000多種。遺傳疾病的治療一直困擾著患者家庭和醫療工作者。新型基因編輯技術TALEN和CRISPR/Cas9 技術分別在2012、2013和2015年被 Science 評為十大科學突破之一，是有望徹底終結遺傳病的工具。

2015年，我們團隊在全世界範圍內首次嘗試利用人的三原核胚胎（臨床廢棄的不能存活的異常胚胎）研究了CRISPR/Cas9在根治地中海貧血症遺傳疾病方面的潛能和風險，發現了在早期三原核胚胎中進行基因編輯還存在脫靶、胚胎鑲嵌性和同源重組效率不高等重大瓶頸問題。這些風險也在後續廣州醫學院第三附屬醫院范勇團隊和劉見橋團隊的人胚胎基因編輯研究工作中所證實。

在人生殖細胞中的基因編輯工作也引發了全球社會人士和科學家的熱點關注，促使了2015年底由美國國家科學院、美國國家醫學院、中國科學院和英國皇家學會共同舉辦的華盛頓人類基因編輯國際峰會的召開，會議明確了體細胞基因編輯研究和臨床前早期人類胚胎以及生殖細胞基因編輯基礎研究的重要性。隨後，2016年2月英國批准在人早期胚胎中進行基因編輯研究；2016年9月，瑞典科學家宣布在正常人類胚胎進行基因編輯研究；2017年2月美國科學院與美國醫學院發布了《Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance》，明確地支持臨床前早期人類胚胎以及生殖細胞基因編輯基礎研究，而臨床應用則取決於具體的情況，沒有絕對禁止胚胎基因編輯治療遺傳性疾病的可能。英國和瑞典科學家的研究主要是通過基因編輯技術來研究胚胎早期發育重要基因的功能，而今天發表在Nature雜誌，由美國科學家Shoukhrat Mitalipov領導，Sanjiv Kaul、Jin-Soo Kim、Paula Amato和Juan carlos izpisua Belmonte作為共同通訊作者的文章「Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos」則是研究如何提高通過CRISPR/Cas9技術在人類早期正常胚胎中治療遺傳性疾病的潛能。

文章重點關注常染色體顯性遺傳病肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)。心肌肌球蛋白結合蛋白-C(MyBP-C)的編碼基因MYBPC3，是人類發現的第二個HCM致病基因。該基因突變類型以無義突變和移碼突變為主，攜帶者約佔所有HCM患者的30～40％。儘管部分錯義突變能夠降低MyBP-C與肌球蛋白結合的能力，但多數錯義突變既不影響MyBP-C的功能，也不影響其穩定性。

總體來說，絕大多數MYBPC3突變屬於低危突變。文章利用MYBPC3雜合突變的男性患者的皮膚成纖維細胞製備了誘導多能性幹細胞（iPS）以及利用該患者的精子，通過卵胞漿內單精子顯微注射技術(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)與正常卵子結合獲得的正常二倍體胚胎為模型，研究特異靶向突變MYBPC3基因位點的CRISPR/Cas9系統聯合ssDNA oligo在人iPS和受精卵疾病模型中修復MYBPC3雜合突變的效率。

在iPS細胞模型中，作者發現了10個通過HDR修復的iPS細胞克隆，而這些克隆的基因編輯傾向於採用外源的ssDNA為修復模板進行同源重組修復（HDR）(9/10)，只有1個克隆是以WT基因拷貝作為模板修復。而在胚胎中，在修復的42個胚胎中，有1個採用WT基因拷貝作為修復模板。這結果與李勁松研究員和我們組分別在小鼠和人三原核受精卵中的研究結果一致，說明人早期胚胎中的HDR機制與細胞不同。

作者進一步比較了在人胚胎受精卵時期（原核期）和MII卵子（ICSI注射期）時期注射CRISPR–Cas9所形成胚胎的鑲嵌性問題，發現通過將精子與CRISPR/Cas9同時注射到MII期的卵子中，顯著降低了基因編輯修復的胚胎中的Mosaic現象。作者認為在早期胚胎中基因組修復更多地採取內源模板利用HDR機制完成，而MII的卵子在ICSI後經歷了S和G2的細胞周期，也促進了HDR的發生。這些研究結果的發現正是得益於課題組使用正常的人早期胚胎以及結合了體外試管嬰兒的ICSI技術，這也是三原核胚胎研究的不足之處。

此外，由於論文所用的受精卵全部是雜合子或者野生型的胚胎，大量的研究表明發現，如果僅僅是通過PCR擴增單個卵裂球細胞，等位基因的PCR擴增是有偏好性的，會影響後續深度測序的結果，導致數據可能存在偏差。論文的方法是否在不同的遺傳疾病基因，不同的突變位點依然獲得高效的修復結果仍然需要更多的研究。在純合子的遺傳突變疾病中，該方法在缺乏內源WT基因模板的時候，能否高效地利用外源DNA模板修復仍需要進一步的探討。總的來說，論文研究結果對於後期如何開展雜合子遺傳疾病有著重要的指導意義。

2015 年 3 月，MIT Technology Review 發表了一篇名為「Engineering the Perfect Baby」的文章，Nature 和 Science 雜誌皆發表評論性文章，呼籲科學家們暫時不要進行人類胚胎進行基因編輯的研究。2017年7月，MIT Technology Review再次發表的「First Human Embryos Edited in U.S.」的文章，而在今天，Nature雜誌刊登了利用正常人類胚胎進行遺傳病基因編輯治療的研究成果。在這巨大的轉變過程中，中國科學家與全球科學家一起努力實現了該研究領域的良性發展。美國科學家在NIH禁止將聯邦資金用於此類研究資助的情況下，更是走在了國際的前列。回顧生殖發育領域的發展歷史，對人類生殖疾病治療密切相關的前沿研究，如試管嬰兒技術研究、人克隆胚胎技術、人獸混合胚胎研究、人獸嵌合體胚胎研究、人「三親」試管嬰兒研究等等，基本都是由歐洲和美國所完成和主導。目前在人類胚胎中利用基因編輯技術研究早期胚胎髮育和遺傳疾病研究的重要性已經成為了國際共識，相信在今後在國內和國外同行的努力下還會有更多重要的研究成果出現。

參考文獻：

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2、Tachibana, M., Amato, P., Sparman, M., Woodward, J., Sanchis, D. M., Ma, H., ... & Mitalipov, S. (2013). Towards germline gene therapy of inherited mitochondrial diseases. Nature, 493(7434), 627-631.

3、Tachibana, M., Amato, P., Sparman, M., Gutierrez, N. M., Tippner-Hedges, R., Ma, H., ... &Mitalipov, S. (2013). Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell, 153(6), 1228-1238.

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Shoukhrat Mitalipov 1961年出生於哈薩克共和國（Kazakhstan，1991年宣布獨立，此前為前蘇聯的一部分），從1979年開始他作為一名無線電技術員曾在蘇聯軍隊服役兩年，服役後進入了位於莫斯科的季米利亞捷夫農學院（Timiryazev Agricultural Academy）學習遺傳學，1994年在莫斯科醫學遺傳學研究中心（Research Center for Medical Genetics）獲得博士學位，主要從事發育與幹細胞相關研究。由於蘇聯解體後，相關經費縮減，Mitalipov申請到了美國猶他州立大學的Fellowship開始了博士後研究，從1998年起，開始在俄勒岡健康與科學大學（Oregon Health and Science University）國家靈長類動物研究中心（Oregon National Primate Research Center）工作至今。Mitalipov此前因為置換了一對孿生雄猴的線粒體而名噪一時（2009，Nature），此後在此基礎上進一步獲得了置換線粒體的人類卵細胞而進一步走進公眾視野（2012，Nature），2013年更是因為通過核移植技術首次獲得了人類胚胎幹細胞而引發學術界和大眾的熱議（2013，Cell），如今Mitalipov又成為了美國第一位利用基因編輯技術編輯人類胚胎的科學家再次進入各大新聞媒體的頭條。

另據悉，Shoukhrat Mitalipov博士最近剛剛入選了國家第十三批「千人計劃」（短期項目），將在山東大學生殖醫學研究中心任職。

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