[線上課堂5]范可尼貧血的綜合診斷流程

06-10

FA患者的DNA修復相關蛋白質有遺傳缺陷，導致DNA損傷反應系統受損。約60-75％的患者有先天性缺陷，一般表現為身材矮小，畸形手臂，頭部，眼睛，腎臟和耳朵，以及發育障礙。大約75％的患者有某種形式的內分泌問題，程度不一。FA人群中，大多數患有癌症，最常見的是急性髓系白血病。雄激素和造血生長因子治療可暫時幫助緩解骨髓衰竭，骨髓移植是長期緩解的唯一治療方式。

△ 圖1 FA患者的臨床表現

雖然 FA 是先天性疾病，但是 FA 的患者卻通常不能在兒童期得到有效診斷。FA較為罕見，臨床表現具有高度異質性，且與其他疾病的某些癥狀相似，所以很難基於臨床特徵進行早期診斷，通常直到患者發展為白血病或實體瘤以後，才有可能被明確診斷。

即使患者表現出一些「典型」的FA癥狀，也不能完全確診為FA。FA患者的T淋巴細胞染色體須表現出對DNA交聯劑（如絲裂黴素C（MMC），二環氧丁烷（DEB）或順鉑）非常敏感。

所有患有再生障礙性貧血的兒童都應該作為FA篩查對象進行檢測；對於患有癌症的兒童和成人，如果對化療或放療等DNA損傷劑有異常反應（如嚴重皮膚反應或粘膜炎，長期發育不良等）也應該進行FA篩查實驗；年齡相對較小的成人癌症患者（癌症通常位於口腔/食道或肛門生殖器區域），也應考慮FA。

染色體畸變實驗是診斷FA的金標準。需要注意的是，某些疾病此實驗也會陽性，還需要鑒別診斷。據報道，Nijmegen breakage綜合征的一些病例會出現陽性結果，可以通過篩查NBS1基因的突變來排除Nijmegen breakage綜合征。此外，患有Cohesinopathies Roberts綜合征（ESCO2突變）和Warsaw breakage綜合征（DDX11突變）的患者也可表現出陽性結果。

染色體畸變實驗在FA的應用

染色體畸變實驗的原理

在染色體畸變實驗（即協和華美開設的「MMC+SCGE實驗」）中，將患者的血液標本培養於含有刺激淋巴細胞分裂的化學物質（如植物凝集素）的外周血培養基中；培養的同時加入誘導DNA交聯的化學製劑，如絲裂黴素C（MMC）和/或二環氧丁烷（DEB）處理培養物；評估細胞中的斷裂染色體和重排染色體。

正常細胞可以糾正由DNA交聯劑引起的大部分染色體損傷，而來自FA患者的細胞通常顯示繁多的染色體斷裂和染色體重排。

△ 圖2 染色體畸變實驗陰陽性對比圖

畸變染色體的判定

畸變染色體通常可以分為4大類

1、斷裂染色體

斷裂染色體包含染色體臂出現斷裂間隙和染色體臂斷裂兩類，此類畸變計1次「斷裂事件」。

2、三射體染色體

2個不同染色體發生斷裂後，錯誤修復形成的染色體，此類畸變計2次「斷裂事件」。

3、四射體染色體

2個不同染色體發生斷裂後，錯誤修復形成的染色體，此類畸變計2次「斷裂事件」。（畸變後鏡下狀態與三射體區分見下圖）

4、複雜染色體

多個染色體、多次斷裂、多次斷裂修復形成的複雜染色體，此類畸變原則上採用「參與複雜染色體形成的染色體數目」+「斷裂點數目」=「總斷裂事件數」公式，進行「斷裂事件」計數。

△ 圖3 畸變染色體舉例

實驗室結果的判讀

對患者的染色體分裂相進行「斷裂事件」計數，一個分裂相中「斷裂事件」總數超過10的，計10（這是為了防止個別嚴重畸變的分裂相對總體分值的影響過高導致判讀錯誤）。

根據積分結果可將患者分為三類：

1、FA陽性

此類患者每個染色體分裂相均可表現出不同程度的染色體畸變，通常在300nM的 MMC藥物作用下，絕大多數分裂相的「斷裂事件」都會超過10

2、FA陰性

在300nM的 MMC藥物作用下，患者幾乎沒有「斷裂事件」積分超過10的分裂相，大多數是0-3個「斷裂事件」。

3、FA-mosaic

這是一種FA嵌合體患者，患者染色體分裂相表現出兩種群類，第一群類與FA陽性患者表現一致，即分裂相「斷裂事件」通常超過10，第二群類與FA陰性患者表現一致，即分裂相「斷裂事件」積分通常為0-3。

△ 圖4 實驗結果判讀指示圖

二代測序技術在FA診斷中的應用

目前已經發現至少16種基因突變與FA的發生密切相關，這16種基因是FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1 (BRCA2), FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ (BRIP1), FANCL, FANCM, FANCN (PALB2), FANCO, FANCP (SLX4), FANCQ (XPF/ERCC4)，與之對應的FA分型分別是FA-A,-B,-C,-D1,-D2,-E,-F,-G,-I,-J,-L ,-M,-N,-O,-P和-Q。

這些基因的詳細信息如圖5 ?

△ 圖5 FA相關基因的基本信息

除FANCB基因位於X染色體外，其他基因都位於常染色體，FANCB之外的FA突變基因的遺傳規律遵循下圖：

△ 圖6 FA突變基因遺傳規律

如果患者染色體畸變實驗呈陽性，則應進行二代測序突變分析以確定導致患者發展為FA的特定基因突變。

確定致病突變基因的必要性表現在以下幾個方面：

1、能夠對家族成員進行突變特異性檢測，並且可以準確診斷只有一個FA基因突變拷貝的個體（例如FA患者的父母），這些個體通常沒有FA的臨床表現；以及對具有兩個FA基因突變拷貝（例如患者）的個體進行診斷。這些信息可以為遺傳諮詢提供幫助。

2、可用於婚前篩查，產前診斷。

3、有助於準確分析潛在骨髓捐獻者的基因型，例如捐獻者沒有任何FA的癥狀，但他可能是FA患者的直系親屬，任何攜帶FA突變基因的個體都不會被用作捐獻者。

4、可以對臨床癥狀較輕的FA患者進行密切監測，幫助預測其發展為再生障礙性貧血，骨髓增生異常綜合征，白血病或實體瘤的潛在風險。

5、可以為基因治療和未來藥物的發展提供關鍵信息。

協和華美實驗室開設畸變染色體實驗（即「MMC+SCGE實驗」）及二代測序基因篩查項目，可針對范可尼貧血進行多種檢測。

標本要求

染色體畸變實驗

標本採集：肝素抗凝管（綠帽）

樣本類型：外周血

采血量：≥ 4ml

報告周期：樣本接收後1周

二代測序項目

標本採集：枸緣酸鈉抗凝管（藍帽）或EDTA抗凝管（紫帽）

樣本類型：外周血或DNA

采血量：≥5ml（當WBC≤4×10⁹/L,尤其是SCN和AA患者，需酌情增加標本量）

DNA：濃度≥20ng/μl，純度260/280=1.8~2.0，體積≥30μl。

報告周期：樣本接收後2-4周