聯合外泌體RNA和ctDNA的液體活檢，對EGFR突變的檢測最為有效

對癌症的分子複雜性和致癌驅動因素的作用日益深入的理解已經使得癌症的治療越來越有針對性。通常在診斷時，醫生利用獲得的腫瘤組織進行活組織檢查從而獲得靶向治療所需的分子分析結果。然而，腫瘤組織活檢有幾個局限性，包括手術的創傷和由於腫瘤異質性或者低腫瘤細胞比例導致假陰性結果的風險。另外，多達49％的晚期或轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）沒有獲取的腫瘤組織。因此，通過體液如血液或尿液進行的腫瘤相關突變的非侵入性檢測是基於組織活檢方法的最有吸引力的替代方法。

循環腫瘤DNA（ctDNA）是從腫瘤部位釋放到癌症患者血液中的循環無細胞DNA（cfDNA）的組成部分，ctDNA作為非小細胞肺癌和其他癌症的腫瘤組織活檢的替代物，具有巨大的應用前景。這使得最近美國和歐洲的血液EGFR伴侶診斷試驗的監管批准。此外，已經開發出高度敏感和選擇性的技術來解決癌症患者血液中經常發現的相對於野生型的極低比例的腫瘤來源的突變DNA的檢測。在這方面，基於數字PCR技術的BEAMing（Beads,、Emulsification、Amplification、Magnetics）技術可以識別低至0.02%突變等位基因（MAF）的突變，已被證明是最敏感的ctDNA的突變檢測，並且與下一代測序（NGS）技術達到了相似的水平（0.05％MAF）。除此之外，還需克服的困難是患者的體細胞基因的改變帶來的少量的ctDNA檢測是目前的腫瘤生物學無法完成的。可檢測ctDNA的患者的比例因其適應症、疾病階段、腫瘤負荷和其他臨床特徵而異。在NSCLC中，EGFR激活突變的患者（包括外顯子19缺失和外顯子21的L858R點突變）是可以接受各種EGFR抑製劑治療的，並獲得FDA批准的首例液體活檢項目。在使用第三代EGFR酪氨酸激酶抑製劑（EGFR-TKI）來治療EGFR T790M抗性突變的複發性NSCLC患者時，由於血液中ctDNA的水平有限，T790M檢測的假陰性率經常>30％。第一個FDA批准的Rochecobas?EGFR Mutation Test v2 for T790M的靈敏度僅為58.4％，特異性為80.4％。

克服ctDNA突變檢測數量限制的一個手段可能會是來自外泌體的腫瘤相關RNA。外泌體是由活細胞（包括腫瘤細胞）釋放的小囊泡，並攜帶RNA、DNA和蛋白質。使用外泌體RNA（exoRNA）來識別腫瘤起源的體細胞突變先前已被證明，但exoRNA和cfDNA二者的組合（exoNA）尚未被闡述，也沒有闡述比單獨使用ctDNA的優勢。外泌體的一個重要特徵是，存在於血漿和其他生物流體的核酸是在這些囊泡的內腔中的，這些核酸結構完好，免受核酸酶的消化，是良好質量的RNA。此外，外泌體從由活細胞中主動釋放出來，而ctDNA則是通過細胞凋亡或壞死從死亡細胞中釋放出來的。研究人員推測，外泌體RNA上存在的額外突變以及它們來源於活躍生長的腫瘤細胞可能有助於改進目前基於血漿的EGFR突變檢測。

圖1：該臨床試驗中NSCLC患者的分組情況

在這項發表於Annals of Oncology雜誌（IF 11.854）的研究中，研究人員分析了來自IIIB和IV期NSCLC患者參加TIGER-X試驗（第三代EGFR抑製劑rociletinib的1/2期臨床試驗，編號NCT01526928）的84個血漿樣品。研究人員分離外泌體和ctDNA，並提取核酸，並使用有針對性的NGS分析（EXO1000）來篩選EGFR突變。該研究的主要目的是檢測同時提取exoRNA和ctDNA是否會增加拷貝數和EGFR突變檢測的敏感性，尤其是在通過腫瘤活組織檢查已知EGFR突變陽性的患者中，不通過只單獨的分析ctDNA鑒定EGFR突變檢測。研究人員將數據與匹配的組織數據進行比較，並匹配先前用BEAMing獲得的ctDNA結果。此外他們通過分析治療15天後收集的血漿，檢測了治療期間EGFR突變水平的變化是否與治療結果相關。

圖2：聯合外泌體RNA和ctDNA的exoNA檢測效果和單獨ctDNA檢測效果的比較

研究結果發現，對於exoNA（exoRNA和cfDNA二者的組合），檢測EGFR激活突變的靈敏度為98％，EGFR T790M為90％。BEAM對ctDNA的敏感性分別為82％，T790M為84％。在一胸內轉移亞組患者中（M0/M1a; n=21），利用exoNA的檢測，EGFR激活突變的檢測靈敏度從26％上升到74％（p = 0.003），T790M的靈敏度從19％上升到31％。綜上所述，exoRNA和ctDNA的聯合檢測增加了血漿中EGFR突變檢測的敏感性，並在已知具有低水平ctDNA的M0/M1a患者中看到檢測的改善，該方法也對於僅基於ctDNA的突變檢測提出了新的挑戰。

參考文獻： Krug AK et al. Improved EGFR mutation detection using combined exosomal RNA and circulating tumor DNA in NSCLC patient plasma. Ann Oncol. 2017 Dec 5.