DAPK1在下咽鱗狀細胞癌中的異常甲基化及表達

研究背景下咽部的惡性腫瘤是頭頸部惡性程度最高的腫瘤之一,而鱗狀細胞癌是最常見的惡性腫瘤類型,下咽鱗狀細胞癌佔頭頸腫瘤的5%左右。下咽癌的發生、發展是一個多階段的過程,其中包含了多個基因水平的改變。由於其解剖部位的特殊性,下咽癌的早期癥狀不明顯,且大多數分化程度較差,局部呈侵襲性生長並易沿黏膜下浸潤和擴散,在病程早期就容易出現頸部淋巴結的轉移。現如今,多學科聯合綜合治療是下咽鱗狀細胞癌主要的治療方案,包括手術、放射療法及化療,近年來,儘管治療方法得到了很大的改進,但是下咽癌的預後仍不盡如人意,5年生存率僅在40-50%左右。死亡相關蛋白激酶-1(DAPk1,或簡稱為DAPk)是近年來發現的一種抑癌基因,屬於DAPk蛋白家族,後者包括DAPk1, DAPk2/DRP-1, DAPk3/ZIPk/Dlk, DRAK1和DRAK2。DAPk1定位於人染色體9q34.1,編碼的蛋白分子量為160-kD,由1430個氨基酸組成。它由酶催化區、鈣調蛋白調節區、8個錨蛋白重複序列、ROC-COR域,死亡結構域和富含絲氨酸的C-末端組成。DAPk1是一種凋亡的正性調節因子,且作為一種絲氨酸/蘇氨酸調節激酶,DAPk1參與到多種信號通路調節凋亡、自噬、半胱天冬酶依賴的細胞死亡、細胞粘附和遷移。因此,它不僅起到在炎症反應中起到一定的作用,還發揮著抗腫瘤與抑制轉移的功能。現如今,越來越多關於DAPk1的抗腫瘤功能被陸續發掘,包括抑制整合素信號、推動失巢凋亡、抑制細胞活動、腫瘤代謝的調節等。作為一個抑癌基因,DAPk1在許多種類的腫瘤中都呈現表達下調,而DNA啟動子區CpG島的甲基化被認為是一個主要的機制,它能夠影響基因轉錄活性,卻不涉及DNA的序列改變。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要機制,與細胞生長、分化及轉化密切相關,在腫瘤的發生、發展中也起到重要的作用。抑癌基因的DNA啟動子區CpG島異常甲基化在許多腫瘤中均頻繁發生,DNA啟動子區的高甲基化狀態可通過基因失活、刪失及突變等方式導致基因沉默。DAPk1的異常甲基化在許多腫瘤中均有報道,包括喉癌、結直腸癌、乳腺癌等。目前尚未有關於DAPk1在下咽癌中的甲基化及表達情況的類似報道,因此,在本次研究中,我們擬通過檢測DAPk1在下咽癌中的甲基化及表達情況,探討其與臨床病理特徵和預後的關係。目的我們收集了53對下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織和癌旁非腫瘤黏膜組織樣本,擬檢測下咽鱗狀細胞癌中DAPk1的甲基化及表達情況,分析其與臨床病理特徵的關係,並評價DAPk1對下咽癌患者預後的影響。方法1.53對腫瘤組織及癌旁非腫瘤黏膜組織樣本來源於2010年山東大學齊魯醫院耳鼻咽喉科的下咽鱗狀細胞癌住院手術患者。腫瘤組織取自腫瘤的中心,而相應的癌旁非腫瘤黏膜組織取自距離腫瘤邊緣至少2cm的形態學正常的黏膜組織。2.我們採用甲基化特異性PCR(MSP)來檢測樣本中DAPk1的甲基化狀態,並利用實時定量RT-PCR、免疫組織化學染色和蛋白質印跡分析分別從mRNA水平和蛋白水平檢測DAPk1的表達情況。分析DAPk1的甲基化及表達情況之間的關係,以及其與患者的臨床病理特徵和預後的關係。結果1. DAPk1甲基化檢測結果顯示在下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織中甲基化率為60.38%(32/53),癌旁非腫瘤黏膜組織中甲基化率為26.42%(14/53),下咽癌中腫瘤組織的甲基化率明顯高於癌旁組織,兩者之間的差異具有統計學意義(P=0.001)。2.實時定量RT-PCR中腫瘤組織的DAPk1mRNA相對表達量(0.863+0.095)較癌旁非腫瘤黏膜組織中(1.000)明顯下調(P＝0.002)；蛋白質印跡分析腫瘤組織中DAPk1的蛋白表達水平(0.459±0.036)較癌旁非腫瘤黏膜組織中(0.666+0.037)明顯降低(P<0.001)；免疫組織化學染色中,DAPk1蛋白主要在胞漿表達,DAPk1在腫瘤組織中的蛋白表達陽性率為32.08%(17/53),低於癌旁非腫瘤黏膜組織中的58.49%(31/53)(P=0.006)。以上結果顯示在下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織中DAPk1的mRNA及蛋白水平較癌旁非腫瘤黏膜組織均明顯降低,差異具有統計學意義。3.下咽癌腫瘤組織中甲基化組的DAPk1mRNA相對表達量為0.633+0.095,顯著低於非甲基化組的DAPk1mRNA相對表達量(1.212+0.167),兩者之間的差異具有統計學意義,DAPk1甲基化與mRNA的相對表達之間的關係呈負相關(P=0.002,r=-0.521)。存在區域淋巴結轉移的病例中,其DAPk1甲基化程度增高(P=0.001),且mRNA表達降低(0.516±0.069v.s.1.128±0.142,P=0.001)；同樣地,在高等級的TNM分期中,即Ⅲ期和Ⅳ期的病例中,DAPk1甲基化程度增高(P=0.009),且mRNA表達降低(0.698±0.096v.s.1.156±0.188,P=0.019)。腫瘤組織中DAPk1甲基化、mRNA表達與年齡、原發腫瘤分期、組織病理學分級無關。4.生存分析結果顯示在53例下咽鱗狀細胞癌患者中,DAPk1未甲基化組患者的生存率顯著高於甲基化組患者(P=0.031), DAPk1的mRNA表達上調組的患者生存率也顯著高於表達下調組(P=0.045)。在多因素Cox比例風險回歸分析中,區域淋巴結轉移是影響預後的獨立危險因素(P=0.043,HR5.387,95%CI1.052-27.600)。而DAPk1在腫瘤組織中的甲基化、mRNA表達,原發腫瘤分期、臨床TNM分期均不能作為獨立危險因素,它們協同發揮作用從而影響下咽鱗狀細胞癌患者的預後。結論DAPk1在下咽鱗狀細胞癌腫瘤組織中較癌旁非腫瘤黏膜組織中的甲基化率明顯增高,且mRNA及蛋白水平均表達降低,DAPk1的甲基化狀態和mRNA表達情況兩者之間呈負相關。DAPk1的高甲基化及低表達與下咽癌的區域淋巴結轉移、高等級臨床分期及預後不良密切相關,區域淋巴結轉移是影響下咽癌患者預後的獨立危險因素。
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